Com pots triar el microscopi confocal adequat per a tu? Hi ha algun mètode concret?
La microscòpia confocal té més avantatges que la microscòpia de camp ampli. La microscòpia confocal pot fer seccions òptiques contínues de mostres i excloure la interferència del senyal dels plans no focals. Per aquest motiu, l'aplicació de la microscòpia confocal és efectivament més habitual. Tanmateix, cada cop hi ha més microscopis confocals al mercat. Com triar?
La microscòpia confocal té més avantatges que la microscòpia de camp ampli. La microscòpia confocal pot fer seccions òptiques contínues de mostres i excloure la interferència del senyal dels plans no focals. Per aquest motiu, la microscòpia confocal és realment més freqüent. Tanmateix, cada cop hi ha més microscopis confocals al mercat. Com triar? A l'hora d'escollir un microscopi confocal, hi ha dues consideracions bàsiques i importants: el tipus de mostra que voleu estudiar (p. ex., cèl·lules fixes o vives) i el tipus d'assaig que voleu realitzar (p. ex., processos cel·lulars estàtics o dinàmics).
Imatge confocal de cèl·lules fixes
Per a la imatge de cèl·lules o teixits fixats i tenyits, generalment escollim l'escaneig làser confocal (LSCM). Això es deu principalment a que les cèl·lules mortes fixes no tenen esdeveniments biològics ràpids a les cèl·lules vives i es poden beneficiar millor de la resolució espacial més alta de LSCM. La imatge LSCM consisteix a tallar òpticament la mostra mitjançant làser i la velocitat d'escaneig (depenent de la velocitat del mirall de la matriu d'escaneig) és generalment d'1 fps. Els temps d'exposició més llargs signifiquen un major risc de fotoblanqueig, però per a les cèl·lules mortes fixes el temps no és crític i podem fer-ne una mitjana fent diverses fotografies.
Imatge confocal de cèl·lules vives
La imatge de cèl·lules vives requereix una protecció addicional contra entorns hostils. Quan fem imatges, la nostra primera consideració és mantenir la viabilitat i la salut cel·lular. Els elements de calefacció a temperatura constant i els sistemes de perfusió són essencials, especialment per als estudis de lapse de temps. Els esdeveniments bioquímics ràpids que controlen l'estat fisiològic de les cèl·lules vives són el que la majoria de la gent vol estudiar, però aquests esdeveniments són massa ràpids per al LSCM convencional. A més, l'exposició prolongada a LSCM també va provocar danys per llum tòxica a les cèl·lules. Per tant, la imatge de cèl·lules vives requereix microscopis confocals especials.
En general, hi ha dues opcions per a la imatge confocal de cèl·lules vives: confocals d'escaneig làser ràpid i confocals de disc giratori. La microscòpia confocal d'exploració ràpida substitueix els miralls de galvanòmetres més lents per miralls d'escaneig ressonants més ràpids, permetent velocitats d'escaneig de fins a 30 fps; mentre que els confocals de disc giratori (SDCM) tenen l'avantatge d'una exploració més ràpida (tot i que inevitablement amb una pèrdua de resolució espacial), la seva velocitat teòricament pot arribar als 2000 fps (a la pràctica sovint està limitada per altres factors).
Si us preocupa el fotoblanqueig o el senyal de fluorescència molt feble, llavors SDCM pot ser més adequat. SDCM utilitza dos discs giratoris amb micropous disposats per dispersar la llum d'excitació. A diferència de LSCM, que escaneja el punt de mostra, SDCM adquireix diversos punts alhora (uns 100 punts de píxels), de manera que la velocitat augmenta molt i el fotoblanqueig de SDCM i menys fototoxicitat. Tanmateix, també podeu utilitzar confocals d'escaneig ràpid per augmentar la velocitat d'escaneig, combinats amb detectors altament sensibles, i reduir l'energia de la llum d'excitació per reduir la fototoxicitat, que pot mantenir les funcions riques dels confocals tradicionals.
Sistema d'imatge confocal automatitzat
A alguns investigadors els agrada trobar maneres de modificar el microscopi per adaptar-se a les seves necessitats individuals. I alguns investigadors ni tan sols estan interessats en com funcionen realment els microscopis. Per a aquests últims, un microscopi confocal automatitzat pot ser més del seu gust. Per exemple, l'Olympus FluoViewFV10i és un microscopi confocal làser 4-d'escriptori totalment automàtic. La seva estructura compacta integrada gairebé no requereix espai d'instal·lació. Aquest tipus d'instrument és ideal per als investigadors que necessiten fer moltes adquisicions de dades d'imatge cada dia, però per descomptat no reflecteixen totalment la funcionalitat i flexibilitat dels confocals tradicionals. A més, la NikonA1 també és un sistema confocal totalment automàtic. Com la majoria dels microscopis d'exploració confocal convencionals, el NikonA1 utilitza un capçal d'escaneig galvanòmetre, que té una resolució més alta que l'A1R amb un capçal d'escaneig híbrid, però una velocitat lleugerament més lenta (A1R ~ 30 fps)
