Diferències entre els microscopis de fluorescència i els microscopis de llum ordinaris
Els microscopis de fluorescència es diferencien dels microscopis òptics convencionals. En lloc d'observar mostres amb llum d'una font de llum ordinària, utilitzen llum d'una longitud d'ona específica (generalment llum ultraviolada o blau-violada) per excitar substàncies fluorescents dins de l'exemplar en el portaobjectes del microscopi, fent que aquestes substàncies emetin fluorescència. Per tant, la font de llum d'un microscopi de fluorescència no il·lumina directament la mostra; actua com a font d'energia per excitar les substàncies fluorescents endògenes de la mostra. Podem veure l'exemplar no per la il·luminació de la pròpia font de llum, sinó perquè les substàncies fluorescents dins de la mostra absorbeixen l'energia lluminosa d'excitació i després emeten fluorescència.
Es dedueix que la característica clau d'un microscopi de fluorescència és que la seva font de llum pot subministrar llum d'excitació d'una banda de longitud d'ona específica, permetent que les substàncies fluorescents de l'espècimen inspeccionat emetin fluorescència d'intensitat suficient. Mentrestant, un microscopi de fluorescència ha d'estar equipat amb un sistema de filtre corresponent. És un instrument essencial per a la histoquímica de fluorescència. Un microscopi de fluorescència es compon principalment d'una font de llum d'ultra-alta pressió, un sistema de filtres (inclosos filtres d'excitació i filtres de barrera), un sistema òptic i un sistema fotogràfic. Funciona utilitzant llum d'una longitud d'ona específica per excitar substàncies fluorescents.
① Mètodes d'excitació de fluorescència Segons el rang de longitud d'ona de la llum d'excitació, hi ha dos tipus: mètode d'excitació UV (mètode d'il·luminació ultraviolada) i mètode d'excitació BV (mètode d'il·luminació blau-violada). El mètode d'excitació UV utilitza llum ultraviolada de menys de 400 nm per a l'excitació. Genera fluorescència invisible, de manera que la fluorescència observada prové del propi exemplar. Aquest mètode distingeix fàcilment la fluorescència específica de l'autofluorescència del fons.
② Mètode d'excitació BVEl mètode d'excitació BV utilitza llum d'excitació que va del violeta al blau centrada a 404 nm i 434 nm. Com que s'utilitza llum blava per irradiar la mostra, el sistema de filtre d'excitació d'aquest mètode ha de bloquejar completament la llum blava i només permet que la llum verda i groga necessària passi. Per aquest motiu, el conjunt de filtres per a l'excitació de BV ha d'utilitzar un filtre de barrera de tall. Aquest mètode utilitza llum blava per a l'excitació, de manera que l'eficiència de recollida de fluorescència és relativament alta i es poden obtenir imatges més brillants. El seu desavantatge és que la fluorescència per sobre de 500 nm no es pot detectar i només es poden veure imatges groc-verd per sobre de 500 nm. En la tinció d'anticossos fluorescents, el judici de l'especificitat es basa en gran mesura en la informació del color, de manera que l'inconvenient del mètode d'excitació de BV pot ser una limitació important quan es parla de l'especificitat subtil.
