Per què necessito utilitzar un microscopi confocal?
1. El microscopi òptic s'ha perfeccionat gràcies als esforços i millores dels nostres grans predecessors. De fet, el microscopi habitual ens pot proporcionar imatges microscòpiques boniques de manera fàcil i ràpida. Tanmateix, l'esdeveniment que va revolucionar el món dels microscopis gairebé perfectes va ser la invenció del "microscopi confocal d'escaneig làser". Aquest nou tipus de microscopi es caracteritza per un sistema òptic que extreu informació de la imatge només de la superfície on es concentra el focus, i canviant el focus mentre es recupera la informació adquirida a la memòria d'imatge, és possible obtenir una imatge nítida amb informació 3-dimensional completa. D'aquesta manera, és possible obtenir fàcilment informació sobre la forma de la superfície que no es pot confirmar amb un microscopi convencional. A més, tot i que "augmentar la resolució" i "aprofundir en la profunditat del focus" són condicions conflictives per als microscopis òptics convencionals, especialment a gran augment, aquest problema es resol amb els microscopis confocals.
2. Avantatges del sistema òptic confocal
Esquema del microscopi confocal làser
El sistema òptic confocal és una il·luminació puntual de la mostra, mentre que la llum reflectida també es rep mitjançant un receptor puntual. Quan la mostra es col·loca al punt focal, gairebé tota la llum reflectida arriba al fotoreceptor i, quan la mostra està desenfocada, la llum reflectida no pot arribar al fotoreceptor. És a dir, en un sistema òptic confocal, només s'emet la imatge que coincideix amb el punt focal i es bloquegen els punts i la llum dispersa inútil.
3. Per què utilitzar un làser?
En un sistema òptic confocal, la mostra s'il·lumina en un punt i la llum reflectida és rebuda per un sensor puntual. Per tant, és necessària una font de llum puntual. Els làsers són una font de llum puntual. En la majoria dels casos, la font de llum per als microscopis confocals és una font de llum làser. A més, la monocromaticitat, la direccionalitat i l'excel·lent forma del feix dels làsers són motius importants per a la seva adopció generalitzada.
4. És possible l'observació en temps real basada en l'escaneig d'alta velocitat.
Per a l'escaneig làser, s'utilitza una unitat de deflexió òptica acústica (Acoustic Optical Deflector, AO prime) en direcció horitzontal i un mirall d'escaneig de feix controlat servoelectrònicament (Servo Galvano-mirror) en direcció vertical. Com que no hi ha vibració mecànica al deflector AO, és possible l'exploració d'alta velocitat i l'observació en temps real a la pantalla del monitor. L'alta velocitat d'aquesta càmera és un element molt important que afecta directament la velocitat d'enfocament i la recuperació de la posició.
5. Relació entre la posició del focus i la brillantor
En un sistema òptic confocal, la mostra es col·loca correctament a la posició focal quan la brillantor és molt gran, davant i darrere d'ella, la seva brillantor es reduirà bruscament (Figura 4 línia sòlida). Aquesta selectivitat sensible del pla focal és el principi darrere de l'orientació en altura del microscopi confocal i l'expansió de la profunditat del focus. En canvi, els microscopis òptics habituals no mostren cap canvi significatiu en la brillantor abans i després de la posició focal (línia de punts a la figura 4).
6. Alt contrast, alta resolució
En un microscopi òptic convencional, la llum reflectida de la part desenfocada del microscopi interfereix i se solapa amb la part focal d'imatge del microscopi, donant lloc a una disminució del contrast de la imatge. En canvi, en un sistema òptic confocal, la llum dispersa fora del punt focal i dins de la lent de l'objectiu s'elimina gairebé completament, donant lloc a imatges amb un contrast molt alt. A més, es millora el poder de resolució del microscopi perquè la llum passa dues vegades a través de la lent de l'objectiu, augmentant la nitidesa de la imatge puntual.
7. Funció de localització òptica
En el sistema òptic confocal, la llum reflectida està protegida per la micro-obertura en un punt diferent del punt focal. Com a resultat, quan s'observa una mostra tridimensional, la imatge es forma com si la mostra hagués estat tallada amb el punt focal (Fig. 5). Aquest efecte s'anomena localització òptica i és una de les característiques dels sistemes òptics confocals.
