Principis de la microscòpia confocal làser (LSCM)
Un microscopi confocal làser utilitza un forat d'il·luminació col·locat darrere de la font de llum i un forat de detecció situat davant del detector per aconseguir la il·luminació puntual i la detecció puntual. La llum de la font de llum es centra en un punt del pla focal de la mostra per la llum emesa a través del forat d'il·luminació, i la fluorescència emesa des d'aquest punt s'imatge dins del forat de detecció, i qualsevol llum emesa fora d'aquest punt és bloquejada pel forat de detecció. El forat d'il·luminació i el forat de detecció es conjuguen per al punt il·luminat o detectat, de manera que el punt detectat és el punt confocal i el pla on es troba el punt detectat és el pla confocal. L'ordinador mostra el punt detectat a la pantalla de l'ordinador en forma de punt d'imatge. Per tal de produir una imatge completa, un sistema d'escaneig en el camí òptic explora el pla focal de la mostra, produint així una imatge confocal completa. Mentre l'etapa portadora es mogui cap amunt i cap avall al llarg de l'eix Z, un nou nivell de la mostra es mou al pla confocal i el nou nivell de la mostra es mostra al monitor, a mesura que l'eix Z continua. moviment, s'obtenen successives imatges tallades de llum de diferents nivells de la mostra.
El microscopi òptic tradicional utilitza una font de llum de camp, la imatge de cada punt de la mostra es veurà interferida per la difracció o dispersió de la llum dels punts veïns; El microscopi confocal d'escaneig làser utilitza un raig làser a través del forat il·luminat per formar una font de llum puntual a l'espècimen escanejat a cada punt del pla focal intern, l'exemplar al punt irradiat, la imatge del forat de detecció, mitjançant la detecció del forat. després que el tub de multiplicació del punt de llum (PMT) o el dispositiu electroacoblat en fred (cCCD) Rebut punt per punt o línia per línia, es forma ràpidament una imatge fluorescent a la pantalla del monitor de l'ordinador. El forat d'il·luminació i el forat de detecció en relació amb el pla focal de la lent de l'objectiu es conjuguen, el punt del pla focal al mateix temps es centra en el forat d'il·luminació i el forat d'emissió, el punt fora del pla focal no estarà a la detecció de la forat a la imatge, de manera que la imatge confocal obtinguda sigui la secció transversal òptica de l'exemplar, superant les deficiències de la imatge borrosa del microscopi normal.
Des del principi bàsic, el microscopi confocal làser és un microscopi òptic modern, és el microscopi de llum normal de la tecnologia per fer les millores següents.
1. Utilitzeu làser com a font de llum perquè la monocromaticitat del làser és molt bona, la longitud d'ona del feix de la font de llum és la mateixa, eliminant fonamentalment l'aberració cromàtica.
2. L'ús de la tecnologia confocal al pla focal de la lent de l'objectiu col·locat al mig amb un petit forat al deflector, el pla focal fora del bloqueig de la llum dispersa, eliminant l'aberració esfèrica; i eliminar encara més l'aberració cromàtica.
3. Microscopi confocal làser que utilitza tecnologia d'escaneig puntual per descompondre la mostra en un espai bidimensional o tridimensional en infinitat de punts, amb un feix làser molt petit (font de llum puntual) punt per punt, línia per línia d'imatges d'escaneig, i després a través la combinació microordinador d'un pla sencer o imatge tridimensional. El microscopi de llum tradicional és una font de llum de camp sota la imatge única, els exemplars de cada punt de la imatge seran adjacents al punt de llum difractada i interferència de llum dispersa. La claredat i precisió d'aquestes dues imatges no es poden comparar.
4. Adquisició i processament de senyals òptics amb un ordinador i amplificació dels senyals amb un tub fotomultiplicador
En el microscopi confocal làser, l'ordinador substitueix l'ull humà o la càmera per a l'observació i la gravació de vídeo, i les imatges obtingudes es digitalitzen i es poden processar a l'ordinador per tornar a millorar la claredat de les imatges. A més, l'ús de tubs fotomultiplicadors pot amplificar senyals molt febles, millorant molt la sensibilitat. Com a resultat de l'ús combinat de les tecnologies anteriors, es pot dir que el LSCM és el microscopi més avançat del món. Es pot dir que LSCM és la combinació de tecnologia de producció de microscopis, tecnologia fotoelèctrica, tecnologia informàtica **, és el producte inevitable del desenvolupament de la tecnologia moderna.
