Principi i característiques estructurals dels microscopis de fluorescència
La font de llum de fluorescència utilitza generalment una làmpada de mercuri d'ultra-alta pressió (50-200 W), que emet llum de diverses longituds d'ona. Tanmateix, cada substància fluorescent té una longitud d'ona d'excitació específica que genera una fluorescència intensa. Per aquest motiu, es requereix un filtre d'excitació (normalment disponible en tipus ultraviolat, violeta, blau i verd) per permetre que només la llum d'excitació d'una longitud d'ona específica passi i irradii l'exemplar, alhora que absorbeix totes les altres longituds d'ona.
Quan s'irradia per llum d'excitació, cada substància emet fluorescència visible amb una longitud d'ona més gran que la llum d'excitació en un temps extremadament curt. La fluorescència és molt específica i generalment més feble que la llum d'excitació. Per observar aquesta fluorescència específica, s'ha d'instal·lar un filtre de barrera (o supressió) darrere de la lent de l'objectiu. Té dues finalitats: primer, absorbeix i bloqueja la llum d'excitació que entri a l'ocular per evitar interferir amb l'observació de fluorescència i danyar els ulls; segon, transmet selectivament una fluorescència específica per produir un color fluorescent diferent. Els dos tipus de filtres s'han de seleccionar i utilitzar en parells coincidents.
Els microscopis de fluorescència es divideixen en dos tipus segons el seu camí òptic:
1. Microscopi de fluorescència de llum transmesa
En aquest disseny, la font de llum d'excitació travessa el condensador i el material de la mostra per excitar la fluorescència. S'utilitza habitualment un condensador de camp fosc, encara que també es pot aplicar un condensador estàndard; el mirall reflector s'ajusta per redirigir i irradiar lateralment la llum d'excitació a la mostra. Aquest és un tipus de microscopi de fluorescència relativament més antic. El seu avantatge és una forta fluorescència a baix augment, mentre que el seu desavantatge és que la intensitat de la fluorescència disminueix a mesura que augmenta la magnificació. Per tant, és més adequat per observar materials d'exemplars més grans.
2. Microscopi d'epifluorescència
Aquest és un tipus de microscopi de fluorescència modern i recentment desenvolupat. A diferència del disseny de llum transmesa, la llum d'excitació es projecta cap avall a través de la lent de l'objectiu a la superfície de la mostra; la mateixa lent objectiu serveix tant com a condensador d'il·luminació i com a objectiu de recollida de fluorescència. S'instal·la un divisor de feixos dicroic al camí òptic amb un angle de 45 graus amb l'eix òptic. La llum d'excitació es reflecteix a la lent de l'objectiu i es centra en la mostra. La fluorescència generada per la mostra, juntament amb la llum d'excitació reflectida per les superfícies de la lent objectiu i el cobreobjectes, entra simultàniament a la lent de l'objectiu i torna al divisor de feixos dicroic, que separa la llum d'excitació de la fluorescència. Aleshores, la llum d'excitació restant és absorbida pel filtre de barrera.
Mitjançant l'intercanvi de blocs de filtre amb diferents combinacions de filtre d'excitació, divisor de feix dicroic i filtre de barrera, es poden complir els requisits per a diferents productes de reacció fluorescent. Els avantatges d'aquest tipus de microscopi de fluorescència inclouen la il·luminació de camp uniforme, imatges nítides i l'augment de la intensitat de la fluorescència a augments més alts.
