Principi i construcció del microscopi de fluorescència
El microscopi de fluorescència utilitza una font de llum puntual d'alta eficiència lluminosa, que emet una certa longitud d'ona de llum (com ara llum ultraviolada de 3650 polzades o llum blava violeta 4200 polzades) a través d'un sistema de filtrat de color com a llum d'excitació i excita les substàncies fluorescents de la mostra per emeten diferents colors de fluorescència. Després d'això, s'observa mitjançant la ampliació de l'objectiu i l'ocular. D'aquesta manera, fins i tot amb una fluorescència feble, és fàcilment reconeixible i altament sensible sota fons forts contrastats, utilitzat principalment per estudiar l'estructura i la funció cel·lular, així com la composició química. L'estructura bàsica d'un microscopi de fluorescència es compon d'un microscopi òptic normal i alguns accessoris (com ara una font de llum fluorescent, filtre d'excitació, separador de feix bicromàtic i filtre de bloqueig, etc.). Fonts de llum fluorescents: normalment utilitzen làmpades de mercuri d'alta pressió (50-200W), que poden emetre llum de diferents longituds d'ona. Tanmateix, cada substància fluorescent té una longitud d'ona de llum d'excitació que produeix la fluorescència més forta, de manera que cal afegir filtres d'excitació (generalment filtres d'excitació ultraviolats, morats, blaus i verds) per permetre que només una certa longitud d'ona de la llum d'excitació passi i s'il·lumini. l'exemplar, mentre absorbeix tota la resta de llum. Després de ser irradiada per llum excitada, cada substància emet fluorescència visible amb una longitud d'ona més gran que la irradiació en un període de temps molt curt. La fluorescència té especificitat i és generalment més feble que la llum d'excitació. Per observar una fluorescència específica, cal afegir un filtre de bloqueig (o supressió) darrere de la lent de l'objectiu. Té dues funcions: en primer lloc, absorbeix i bloqueja la llum d'excitació que entri a l'ocular per evitar pertorbar la fluorescència i danyar els ulls; en segon lloc, selecciona i permet que passi una fluorescència específica, mostrant un color de fluorescència específic. Els dos tipus de filtres s'han de seleccionar per utilitzar-los conjuntament.
Hi ha dos tipus de microscopis de fluorescència segons el seu camí òptic:
1. Microscopi de fluorescència de transmissió: la font de llum d'excitació es transmet a través del material de la mostra a través d'un condensador per excitar la fluorescència. Els col·lectors de llum de camp fosc d'ús habitual, o els col·lectors de llum normals, es poden utilitzar per ajustar el reflector per convertir la llum d'excitació i la llum lateral a la mostra. Aquest és un microscopi de fluorescència relativament antic. El seu avantatge és que la fluorescència és forta a baix augment, mentre que el seu desavantatge és que la fluorescència es debilita a mesura que augmenta la magnificació. Per tant, és millor observar materials d'exemplars més grans.
2. Microscopi de fluorescència de feix caiguda Aquest és un nou tipus de microscopi de fluorescència desenvolupat en els temps moderns. A diferència de l'anterior, la llum d'excitació cau des de la lent de l'objectiu a la superfície de la mostra, utilitzant la mateixa lent objectiu que el condensador d'il·luminació i la lent objectiu per recollir la fluorescència. Cal afegir un separador de feix de color dual al camí òptic, que està en un angle de 45 graus amb l'urani lleuger. La llum d'excitació es reflecteix a la lent de l'objectiu i es concentra a la mostra. La fluorescència generada per la mostra, així com la llum d'excitació reflectida per la superfície de la lent de l'objectiu i el vidre de la coberta, entren a la lent de l'objectiu simultàniament i tornen al separador de feix dicroic, separant l'excitació i la fluorescència. L'excitació residual és llavors absorbida pel filtre de bloqueig. Si s'utilitzen diferents filtres d'excitació/separadors de feix de color dual/combinacions de filtres de bloqueig, poden satisfer les necessitats de diferents productes de reacció fluorescent. L'avantatge d'aquest microscopi fluorescent és que la il·luminació del camp de visió és uniforme, la imatge és clara i com més gran sigui l'augment, més forta serà la fluorescència.
