Classificació microscòpica i principi de funcionament per a la investigació cel·lular
El microscopi és l'eina principal per observar les cèl·lules. Segons diferents fonts de llum, es pot dividir en dues categories: microscopis òptics i microscopis electrònics. El primer utilitza llum visible (els microscopis UV utilitzen llum ultraviolada) com a font de llum, mentre que el segon fa servir feixos d'electrons com a font de llum.
-,Microscopi òptic
(1) Microscopi òptic ordinari
Els microscopis biològics ordinaris es componen de tres parts, a saber: ① sistema d'il·luminació, inclosa la font de llum i el condensador; ② Sistema d'ampliació òptic, compost per lent objectiu i ocular, que és el cos principal del microscopi. Per tal d'eliminar l'aberració esfèrica i l'aberració cromàtica, tant l'ocular com l'objectiu ③Dispositiu mecànic, utilitzat per fixar el material i facilitar l'observació (Figura 2-1).
Que la imatge del microscopi sigui clara no només depèn de l'ampliació, sinó que també està relacionada amb la resolució del microscopi. La resolució es refereix a la capacitat del microscopi (o l'ull humà d'estar a 25 cm de distància de l'objectiu) per distingir la distància més petita entre objectes. La mida de la resolució ve determinada per La longitud d'ona i la relació d'obertura de la llum i l'índex de refracció del medi s'expressen per la fórmula:
En la fórmula: n=índex de refracció del medi;=angle d'obertura (l'angle d'obertura de la mostra amb l'obertura de la lent de l'objectiu), NA=obertura de la lent (obertura numèrica). L'angle de la lent sempre és inferior a 180 graus, de manera que el valor màxim de sina/2 ha de ser inferior a 1.
L'índex de refracció del vidre utilitzat per fer la lent òptica és d'1,65 a 1,78, i l'índex de refracció del medi utilitzat està més a prop del vidre, millor. Per a les lents d'objectius secs, el medi és l'aire i la relació d'obertura de la lent és generalment 0.05 a 0,95; per a les lents d'oli, s'utilitza oli de cedre com a mitjà i la relació d'obertura de la lent pot ser propera a 1,5.
La longitud d'ona de la llum ordinària és de {{0}}nm, de manera que el valor de resolució del microscopi no serà inferior a 0,2μm i la resolució de l'ull humà és de 0,2 mm, de manera que el l'augment màxim del disseny general del microscopi sol ser de 1000X.
(2) Microscòpia de fluorescència
Algunes substàncies de les cèl·lules, com la clorofil·la, poden emetre fluorescència després de ser irradiades pels raigs ultraviolats; algunes substàncies no poden fluorescència, però si es tenyeixen amb colorants fluorescents o anticossos fluorescents, també poden emetre fluorescència quan s'irradien amb raigs ultraviolats, i el microscopi de fluorescència (Fig. 2-2, 3, 4) és una de les eines. per a la investigació qualitativa i quantitativa sobre aquestes substàncies.
Els microscopis de fluorescència i els microscopis ordinaris tenen les següents diferències:
1. El mètode d'il·luminació sol ser epi-il·luminació, és a dir, la font de llum es projecta sobre la mostra a través de la lent de l'objectiu (Figura 2-3);
2. La font de llum és llum ultraviolada, la longitud d'ona és més curta i la resolució és més alta que la dels microscopis normals;
3. Hi ha dos filtres especials, el de davant de la font de llum s'utilitza per filtrar la llum visible, i el que hi ha entre l'ocular i la lent de l'objectiu s'utilitza per filtrar la llum ultraviolada per protegir els ulls.
(3) Microscopi confocal d'exploració làser
El microscopi d'exploració confocal làser (microscopi d'exploració confocal làser, figura 2-5, 6) utilitza el làser com a font de llum d'escaneig i escaneja la imatge punt per punt, línia per línia, superfície per superfície, i el làser d'escaneig i la col·lecció de fluorescència comparteixen una lent objectiu i el focus de la lent objectiu és El punt focal del làser d'escaneig també és el punt objecte de la imatge instantània. Com que la longitud d'ona del feix làser és curta i el feix és molt prim, el microscopi d'escaneig làser confocal té una resolució més alta, que és aproximadament 3 vegades la d'un microscopi òptic normal. El sistema es centra una vegada i l'exploració es limita a un pla de la mostra. Quan la profunditat d'enfocament és diferent, es poden obtenir imatges de diferents nivells de profunditat de la mostra. Aquesta informació de la imatge s'emmagatzema a l'ordinador. Mitjançant l'anàlisi i la simulació per ordinador, es pot mostrar l'estructura tridimensional de la mostra cel·lular.
La microscòpia d'exploració làser confocal es pot utilitzar no només per observar la morfologia cel·lular, sinó també per a l'anàlisi quantitativa de components bioquímics intracel·lulars, estadístiques de densitat òptica i mesura de la morfologia cel·lular.
(4) Microscopi de camp fosc
El microscopi de camp fosc (microscopi de camp fosc, figura 2-7) té un full de llum al centre del condensador, de manera que la llum d'il·luminació no entra directament a la lent humana i només la llum reflectida i difractada per l'exemplar. es permet entrar a la lent de l'objectiu, de manera que el fons del camp de visió és negre, les vores dels objectes són brillants. Amb aquest microscopi, es poden veure partícules tan petites com 4-200nm i la resolució pot ser 50 vegades superior a la dels microscopis normals.
(5) Microscopi de contrast de fase
El microscopi de contrast de fase (microscopi de contrast de fase, figura 2-8, 9) de P. Zernike es va inventar el 1932 i va guanyar el Premi Nobel de Física el 1953 per això. La característica més important d'aquest microscopi és que pot observar exemplars sense taques i cèl·lules vives.
El principi bàsic de la microscòpia de contrast de fase és canviar la diferència del camí òptic de la llum visible que travessa l'espècimen en una diferència d'amplitud, millorant així el contrast entre diverses estructures i fent que diverses estructures siguin clarament visibles. Després de passar a través de la mostra, la llum es refracta, es desvia del camí òptic original i es retarda 1/4λ (longitud d'ona). Enfortir, augmentar o disminuir l'amplitud, augmentar el contrast. Pel que fa a l'estructura, els microscopis de contrast de fase tenen dues característiques especials diferents dels microscopis òptics ordinaris:
1. El diafragma anular es troba entre la font de llum i el condensador, i la seva funció és fer que la llum que travessa el condensador formi un con de llum buit i se centre en la mostra.
2. La placa de fase (placa de fase anular) afegeix una placa de fase recoberta de fluorur de magnesi a la lent de l'objectiu, que pot retardar la fase de llum directa o llum difractada en 1/4λ. Hi ha dos tipus:
①A més placa de fase: la llum directa es retarda 1/4λ. Després de combinar els dos grups d'ones de llum, les ones de llum se sumen i l'amplitud augmenta. L'estructura de l'exemplar és més brillant que el medi circumdant, formant un contrast brillant (o contrast negatiu).
② B més placa de fase: la llum difractada es retarda 1/4λ. Després de combinar els dos conjunts de raigs, les ones de llum es resten i l'amplitud es fa més petita, formant un contrast fosc (o contrast positiu) i l'estructura és més fosca que el medi circumdant.
(6) Microscopi polaritzador
El microscopi polaritzador s'utilitza per detectar substàncies amb birrefringència, com ara filaments, fusos, col·lagen, cromosomes, etc. La diferència amb els microscopis normals és que hi ha un polaritzador (polaritzador) davant de la font de llum, de manera que la llum que entra al microscopi és llum polaritzada, i hi ha un analitzador (un polaritzador la direcció de polarització del qual és perpendicular al polaritzador) en el canó de la lent. El plat d'aquest microscopi es pot girar. Quan es col·loca una substància de refracció única a l'escenari, no importa com es giri l'escenari, ja que els dos polaritzadors són verticals, no es pot veure cap llum al microscopi i la llum no és visible al microscopi. Quan s'introdueixen materials birrefringents, l'etapa giratòria pot detectar aquests objectes perquè la llum es desvia quan passa a través d'aquests materials.
