Coneixements relacionats amb la microscòpia de fluorescència confocal
El principi bàsic de la microscòpia de fluorescència confocal és utilitzar una font de llum puntual per irradiar la mostra, formant un petit punt ben definit al pla focal. La fluorescència emesa pel punt després de la irradiació és recollida per la lent de l'objectiu i enviada de nou a l'espectrofotòmetre compost per un mirall de color bidireccional al llarg del camí d'irradiació original. L'espectrofotòmetre envia fluorescència directament al detector. Hi ha dos forats al davant de la font de llum i del detector, anomenats respectivament forats d'il·luminació i forats de detecció. Les dimensions geomètriques dels dos són consistents, aproximadament 100-200nm; En comparació amb el punt de llum del pla focal, els dos estan conjugats, el que significa que el punt de llum passa a través d'una sèrie de lents i, finalment, es pot centrar tant en el forat d'il·luminació com en el forat de detecció simultàniament. D'aquesta manera, la llum del pla focal pot convergir dins del rang del forat de detecció, mentre que la llum dispersa des de dalt o per sota del pla focal es bloqueja fora del forat de detecció i no es pot capturar. Escanejant la mostra punt per punt amb un làser, el tub fotomultiplicador després de detectar el forat també obté la imatge confocal corresponent del punt de llum punt per punt, que es converteix en un senyal digital i es transmet a l'ordinador. Finalment, a la pantalla es sintetitza una imatge confocal clara de tot el pla focal.
Cada imatge del pla focal és en realitat una secció transversal òptica de la mostra, que sempre té un cert gruix, també conegut com a secció prima òptica. A causa del fet que la intensitat de la llum al punt focal és molt més gran que la del punt no focal, i la llum del pla no focal es filtra per forats, la profunditat de camp del sistema confocal és aproximadament zero. L'escaneig al llarg de la direcció de l'eix Z pot aconseguir una tomografia òptica, formant una llesca òptica bidimensional al punt focal de la mostra observada. Combinant l'escaneig del pla XY (pla focal) amb l'escaneig de l'eix Z (eix òptic), es pot obtenir una imatge tridimensional de la mostra acumulant capes contínues d'imatges bidimensionals i processant-les amb programari informàtic especialitzat.
El forat de detecció i el forat de la font de llum sempre estan enfocats al mateix punt, de manera que la fluorescència excitada fora del pla d'enfocament no pot entrar al forat de detecció.
L'expressió senzilla del principi de funcionament de la microscòpia confocal làser és que utilitza un làser com a font de llum i afegeix un dispositiu d'escaneig làser i un dispositiu d'enfocament conjugat sobre la base de la imatge de microscòpia de fluorescència tradicional. És un sistema controlat per un ordinador per a l'adquisició i processament d'imatges digitals.
