Avantatges de millora de la microscòpia multifotònica d'escaneig làser
La microscòpia multifotònica d'escaneig làser representa un avenç important en la microscòpia òptica. Permet l'observació d'estructures profundes en cèl·lules vives, cèl·lules fixes i teixits, alhora que captura estructures de plànol Z multicapa clares i nítides, és a dir, seccions òptiques, que es poden utilitzar encara més per reconstruir l'estructura sòlida tridimensional dels exemplars.
Un microscopi confocal adopta una font de llum làser. El feix làser s'amplia per il·luminar completament el pla focal posterior de la lent de l'objectiu, després passa a través del sistema de lents de l'objectiu i convergeix en un punt extremadament petit al pla focal de la mostra. Depenent de l'obertura numèrica de la lent de l'objectiu, el diàmetre del punt il·luminat oscil·la aproximadament entre 0,25 i 0,8 μm, amb una profunditat axial d'uns 0,5 a 1,5 μm. La mida del punt confocal ve determinada pel disseny del microscopi, la longitud d'ona del làser, les característiques de l'objectiu, la configuració de la unitat d'escaneig i les propietats de la mostra.
Els microscopis de camp ampli presenten un gran rang d'il·luminació i una profunditat d'il·luminació profunda, mentre que la microscòpia confocal concentra la il·luminació en un punt focal precís del pla focal. L'avantatge bàsic de la microscòpia confocal rau en la seva capacitat per realitzar seccions òptiques fines en mostres fluorescents gruixudes (fins a 50 μm o més), amb el gruix de cada secció que oscil·la entre 0,5 i 1,5 μm.
S'adquireixen una sèrie d'imatges de secció òptica movent la mostra verticalment mitjançant el motor pas a pas de precisió de l'eix Z del microscopi. La col·lecció de senyals d'imatge es limita estrictament al pla focal objectiu i està lliure d'interferències per senyals provinents d'altres posicions dins de la mostra. Després d'eliminar la fluorescència de fons i millorar la relació senyal-soroll, les imatges confocals presenten un contrast i una resolució significativament més alts en comparació amb les imatges tradicionals de fluorescència de camp ampli.
En la majoria d'exemplars, components estructurals complexos s'entrellacen per formar sistemes complexos. Un cop es recullen un nombre suficient de seccions òptiques, es pot completar la reconstrucció tridimensional mitjançant un programari professional. Aquest mètode experimental s'ha aplicat àmpliament en la investigació biològica per aclarir les complexes relacions estructurals i funcionals entre cèl·lules i teixits.
