Com triar el microscopi de fluorescència adequat
El microscopi de fluorescència és un equip d'imatge microscòpica estàndard en laboratoris i departaments de patologia, que utilitza característiques de fluorescència per a l'observació i la imatge. S'utilitza àmpliament en diversos camps com la biologia cel·lular, la neurobiologia, la botànica, la microbiologia, la patologia, la genètica, etc. La imatge de fluorescència té els avantatges d'una gran sensibilitat i especificitat, la qual cosa la fa molt adequada per observar la distribució de proteïnes específiques, orgànuls, etc. . en teixits i cèl·lules, estudiant la colocalització i les interaccions, el seguiment de processos dinàmics de la vida com els canvis de concentració d'ions, etc.
Selecció de microscopis
Els microscopis de fluorescència es divideixen principalment en tres categories: microscopis de fluorescència verticals (aptes per tallar), microscopis de fluorescència invertida (adequats per a cèl·lules vives i també per tallar) i microscopis de fluorescència estereofònic (adequats per a exemplars més grans, com ara plantes, peixos zebra (adults/ embrionari), medaka, òrgans de ratolí/rata, etc.).
Selecció de blocs de filtres fluorescents
La selecció de blocs de filtre no només ha de tenir en compte les longituds d'ona d'excitació i emissió de les sondes fluorescents, sinó que també ha de tenir en compte si hi ha excitació inespecífica i si hi ha diafonia de colors per a mostres marcades amb diversos colors. A l'experiment, triarem la longitud d'ona més propera al pic d'excitació tant com sigui possible per a l'excitació, i el rang de recepció hauria d'incloure l'emissió màxima. El pic d'excitació de l'Alexa Fluor 488 és de 500 nm i es pot seleccionar un filtre d'excitació 480/40 en un microscopi de fluorescència. Els blocs de filtres fluorescents d'ús habitual en microscòpia de fluorescència es poden dividir en dos tipus: passa llarg (LP) i passa banda (BP), que també s'han de seleccionar segons les necessitats.
Microscopi confocal
En les observacions tradicionals de microscòpia de fluorescència, a causa de la superposició de substàncies marcades fluorescents i estructures de fluorescència espontànies, estan estretament unides. Tanmateix, els objectius tradicionals de microscòpia de fluorescència de caiguda no només recullen la llum del pla focal, sinó que també dispersen la llum cap amunt i cap avall pel pla focal, donant lloc a una reducció significativa de la resolució i el contrast de la imatge.
La imatge confocal només detecta la llum reflectida des del pla d'autoenfocament, resolent així el problema anterior. La font de llum forma un punt petit i fi al pla focal a través d'un forat, i la llum emesa des del pla focal es recull a través de la lent de l'objectiu. La majoria de la fluorescència emesa des de punts per sobre o per sota del pla focal de la lent de l'objectiu no pot convergir cap al forat. Només la fluorescència situada al pla focal i una petita part de la fluorescència desenfocada poden passar a través del forat, mentre que el feix de llum fora del pla focal convergeix davant o darrere de la placa del forat i no entri al detector a través del forat. La imatge detectada és del pla focal, de manera que la qualitat de la imatge final es millora molt.
A causa dels diversos avantatges i practicitat de la microscòpia confocal d'escaneig làser, actualment és un assistent experimental indispensable en els camps de la biologia cel·lular, la botànica i la investigació cel·lular d'alta precisió. Al mateix temps, en els futurs centres de recerca científica, serà l'eina de recerca més bàsica i bàsica.
