Tècniques d'extensió de profunditat focal per a microscòpia multifotònica
La combinació d'un microscopi làser de dos fotons i un indicador de calci és l'estàndard d'or per a la detecció de senyals neuronals in vivo. Les neurones de les xarxes neuronals es distribueixen en un espai tridimensional i el seguiment de la seva dinàmica d'activitat requereix una manera de millorar ràpidament la taxa d'imatge de volum. Tanmateix, si s'utilitza un microscopi multifotòn d'escaneig de reixeta per obtenir una imatge d'un gran nombre d'imatges, si s'utilitza un objectiu d'obertura numèrica (NA) alta per aconseguir una resolució lateral més alta, es produirà una profunditat focal més petita. Per obtenir imatges de volum a una profunditat focal reduïda,
Cal realitzar l'escaneig de l'eix Z mitjançant alguns mitjans, obtenint imatges de molts plans escanejant cada pla focal, la qual cosa limita molt la velocitat de la imatge. Si es pot sacrificar la informació de la imatge axial i es pot aconseguir l'exploració de volum en una exploració lateral ampliant la profunditat d'enfocament, és a dir, la informació de volum es projecta en una única imatge 2D, la velocitat d'imatge es pot millorar molt. Això s'anomena imatge de profunditat d'enfocament ampliada (EDF), que és especialment útil per obtenir imatges d'estructures poblacionals disperses que requereixen una alta resolució temporal, com ara imatges funcionals de l'activitat neuronal.
Les resolucions axials i laterals d'un microscopi estan determinades per l'obertura numèrica (NA) de la lent de l'objectiu. Alta NA pot maximitzar la resolució axial i lateral, així com la quantitat de llum recollida; Una NA més baixa donarà lloc a una resolució axial més baixa, és a dir, una major profunditat d'enfocament, però al mateix temps sacrificarà la resolució lateral i l'eficiència de recollida de llum. El mètode d'ampliació de la profunditat d'enfocament que s'introduirà a continuació pot aconseguir-ho tot mantenint una alta resolució lateral i un flux de llum suficient.
L'ús de moduladors de llum espacial per generar feixos focals de Bessel esvelts pot aconseguir imatges EDF, però els moduladors de llum espacials són voluminosos i difícils de ser compatibles amb espais de microscopi estrets; En canvi, els mòduls de Bessel basats en piràmides axials són barats i compactes, però només poden generar punts focals de profunditat fixa i no són adequats per a diversos experiments que requereixen canvis continus de profunditat focal. Per abordar aquest problema, el 2018, RONGWEN LU et al. va demostrar un mòdul de Bessel basat en un axicon, en el qual només cal traduir una lent al llarg de l'eix òptic per ajustar contínuament la longitud axial del punt focal de Bessel.
