Paràmetres tècnics de microscòpia de fluorescència Tècniques i mètodes de microscòpia de fluorescència
Paràmetres tècnics del microscopi de fluorescència 1. Ocular gran angular 2. Objectiu acromàtic 3. Convertidor de lents d'objectiu de quatre forats 4. Dispositiu epifluorescent Blau (B) Verd (G) Sistema d'excitació 10Làmpada de mercuri de 0W 5. Mecanisme d'ajust de l'enfocament gruixut i fi coaxial: ajust Interval d'enfocament: 15 mm Valor de la graella de micromoviment: 0,002 mm 6. Taula mecànica de doble capa Interval de moviment longitudinal: 70 mm Interval de moviment lateral: 50 mm
Paràmetres tècnics del microscopi de fluorescència
1. Ocular gran angular
2. Objectiu acromàtic
3. Nasal de quatre obertures
4. Dispositiu d'epifluorescència blau (B) verd (G) sistema d'excitació làmpada de mercuri de 100 W
5. Mecanisme d'ajust de l'enfocament gruixut i fi coaxial: rang d'enfocament 15 mm valor de quadrícula de moviment fi 0, 002 mm
6. Banc de treball mecànic de doble capa
Interval de moviment vertical: 70 mm Interval de moviment lateral: 50 mm
Habilitats i mètodes de microscòpia de fluorescència
(1) Porta de vidre
El gruix de la diapositiva de vidre ha d'estar entre 0,8 i 1,2 mm. Una diapositiva massa gruixuda absorbirà més llum d'una banda i, d'altra banda, la llum d'excitació no es pot concentrar a la mostra. Les diapositives han de ser llises, de gruix uniforme i lliures d'autofluorescència evident. De vegades s'utilitzen làmines de vidre de quars.
(2) Vidre cobert
El gruix de la coberta de vidre és d'aproximadament 0,17 mm, llisa. Per reforçar la llum d'excitació, també es pot utilitzar un vidre de coberta d'interferència, que és un vidre de coberta especial recobert amb diverses capes de substàncies (com ara fluorur de magnesi) que tenen diferents efectes d'interferència sobre la llum de diferents longituds d'ona, que poden fer que el la fluorescència va sense problemes. La llum excitant es fa passar i es reflecteix, i aquesta llum d'excitació reflectida excita l'exemplar.
(3) Exemplar
Les rodanxes de teixit o altres exemplars no han de ser massa gruixudes. Si és massa gruixut, la major part de la llum d'excitació es consumirà a la part inferior de l'exemplar, mentre que la part superior observada directament per la lent de l'objectiu no s'excitarà del tot. A més, la superposició de cèl·lules o la coberta d'impureses, afecten el judici.
(4) Agent de muntatge
La glicerina s'utilitza habitualment com a agent de muntatge, que no ha de tenir autofluorescència, incolora i transparent, i la brillantor de la fluorescència és més brillant a pH 8.5-9,5, i no és fàcil esvair ràpidament. Per tant, com a agent de muntatge s'utilitza habitualment una barreja igual de glicerol i una solució tampó de carbonat de 0,5 mol/l amb un pH de 9,0 a 9,5.
(5) oli de mirall
En general, quan s'observen mostres amb microscopis de fluorescència de camp fosc i lents d'immersió d'oli, s'ha d'utilitzar oli d'immersió. El millor és utilitzar oli especial d'immersió no fluorescent. També es pot utilitzar la glicerina anterior i també es pot utilitzar parafina líquida, però l'índex de refracció és baix, la qual cosa té un lleuger impacte en la qualitat de la imatge. Influència.
El principi i les característiques estructurals del microscopi de fluorescència
La microscòpia de fluorescència utilitza un punt d'alta eficiència lluminosa per emetre llum d'una certa longitud d'ona (com ara llum ultraviolada de 3650 polzades o llum blava porpra de 4200 polzades) a través del sistema de filtre com a llum d'excitació per excitar les substàncies fluorescents de la mostra per emetre fluorescència de diversos colors Després d'això, observeu a través de l'ampliació de la lent de l'objectiu i l'ocular. D'aquesta manera, sota un fons de fort contrast, encara que la fluorescència sigui molt feble, és fàcil d'identificar i té una alta sensibilitat. S'utilitza principalment per a la investigació de l'estructura i la funció cel·lular i la composició química. L'estructura bàsica d'un microscopi de fluorescència es compon d'un microscopi òptic ordinari més alguns accessoris (com ara una font de llum fluorescent, un filtre d'excitació, un divisor de feix de dos colors i un filtre de bloqueig, etc.). Font de llum fluorescent: generalment s'utilitza làmpada de mercuri d'alta pressió (50-200W), que pot emetre llum de diverses longituds d'ona, però cada substància fluorescent té una longitud d'ona d'excitació que produeix la fluorescència més forta, de manera que un filtre d'excitació (En general, hi ha filtres d'excitació ultraviolat, morat, blau i verd), que només permeten que la llum d'excitació d'una determinada longitud d'ona passi i irradii l'exemplar, alhora que absorbeix una altra llum. Després que cada substància sigui irradiada per llum d'excitació, emet fluorescència visible amb una longitud d'ona més gran que la longitud d'ona d'irradiació en molt poc temps. La fluorescència és específica i generalment més feble que la llum d'excitació. Per observar una fluorescència específica, s'ha d'afegir un bloqueig (o supressió) darrere de la lent de l'objectiu i utilitzar-lo conjuntament.
La diferència entre el microscopi de fluorescència i el microscopi normal
1. El mètode d'il·luminació sol ser episcòpic, és a dir, la font de llum es projecta sobre la mostra a través de la lent de l'objectiu;
2. La font de llum és llum ultraviolada, la longitud d'ona és més curta i la resolució és més alta que la dels microscopis normals;
3. Hi ha dos filtres especials, el de davant de la font de llum s'utilitza per filtrar la llum visible, i el que hi ha entre l'ocular i la lent de l'objectiu s'utilitza per filtrar els raigs ultraviolats per protegir l'ull humà.
El microscopi de fluorescència també és una mena de microscopi òptic, la diferència principal és que la longitud d'ona d'excitació dels dos és diferent. Això determina la diferència entre el microscopi de fluorescència i el microscopi òptic ordinari en termes d'estructura i ús.
La microscòpia de fluorescència és una eina essencial en la citoquímica immunofluorescent. Es compon de components principals com la font de llum, el sistema de plaques de filtre i el sistema òptic. Es tracta d'utilitzar una certa longitud d'ona de llum per excitar l'exemplar per emetre fluorescència i observar la imatge de fluorescència de la mostra amplificant la lent objectiu i el sistema d'oculars.
