La microscòpia de fluorescència difereix de la microscòpia convencional
Els microscopis de fluorescència utilitzen llum ultraviolada com a font de llum per irradiar l'objecte a inspeccionar, de manera que l'objecte emeti llum i, a continuació, observeu l'objecte al microscopi. S'utilitza principalment per a cèl·lules d'immunofluorescència. Es compon principalment d'una font de llum, un sistema de plaques de filtre i un sistema òptic per observar la imatge fluorescent de la mostra mitjançant l'ampliació de l'ocular i la lent de l'objectiu. Fem una ullada a la diferència entre aquest microscopi de fluorescència i un microscopi òptic normal.
1. Mira el mètode d'il·luminació
El mètode d'il·luminació del microscopi de fluorescència és generalment episcòpic, és a dir, la font de llum es projecta sobre la mostra de prova a través de la lent de l'objectiu.
2. Mira la resolució
Els microscopis de fluorescència utilitzen llum ultraviolada com a font de llum i la longitud d'ona és relativament curta, però la resolució és superior a la dels microscopis òptics normals.
3. La diferència en el filtre
Els microscopis de fluorescència utilitzen dos filtres especials, que s'utilitzen davant de la font de llum per filtrar la llum visible i s'utilitzen entre la lent de l'objectiu i l'ocular per filtrar els raigs ultraviolats, que poden protegir els ulls humans.
El microscopi de fluorescència també és una mena de microscopi òptic, principalment perquè la longitud d'ona excitada pel microscopi de fluorescència és curta, de manera que això comporta la diferència d'estructura i ús entre el microscopi de fluorescència i el microscopi normal. La majoria dels microscopis de fluorescència tenen una bona funció de capturar llum feble, de manera que amb una fluorescència extremadament feble, la seva capacitat d'imatge també és bona. Juntament amb la millora contínua dels microscopis de fluorescència en els darrers anys, el soroll també s'ha reduït molt. Per tant, cada cop s'utilitzen més microscopis de fluorescència.
parella
Coneixements sobre microscòpia de fluorescència fotogràfica
El principi bàsic de l'excitació de dos fotons és: en el cas d'alta densitat de fotons, les molècules fluorescents poden absorbir dos fotons de longitud d'ona llarga al mateix temps i emetre un fotó de longitud d'ona més curta després d'una curta vida d'estat excitat; l'efecte és el mateix que utilitzar un fotó amb la meitat de la longitud d'ona de la longitud d'ona llarga per excitar molècules fluorescents. L'excitació de dos fotons requereix una alta densitat de fotons. Per no danyar les cèl·lules, la microscòpia de dos fotons utilitza làsers polsats amb mode d'alta energia. El làser emès per aquest làser té una energia màxima alta i una energia mitjana baixa, l'amplada del pols és de només 100 femtosegons i la seva freqüència pot arribar als 80 a 100 megahertz. Quan s'utilitza una lent objectiu d'obertura numèrica alta per enfocar els fotons del làser polsat, la densitat de fotons al punt focal de la lent objectiu és la més alta i l'excitació de dos fotons només es produeix al punt focal de la lent objectiu, de manera que el El microscopi de dos fotons no requereix un forat confocal, cosa que millora l'eficiència de detecció de fluorescència.
En els fenòmens de fluorescència generals, a causa de la baixa densitat de fotons de la llum d'excitació, una molècula fluorescent només pot absorbir un fotó alhora, i després emetre un fotó fluorescent mitjançant una transició radiativa, que és la fluorescència d'un sol fotó. Per al procés d'excitació de fluorescència utilitzant làser com a font de llum, es pot produir una fluorescència de dos fotons o fins i tot de múltiples fotons. En aquest moment, la intensitat de la font de llum d'excitació utilitzada és alta i la densitat de fotons compleix els requisits de les molècules fluorescents que absorbeixen dos fotons al mateix temps. En el procés d'utilitzar un làser general com a font de llum d'excitació, la densitat de fotons encara no és suficient per produir el fenomen d'absorció de dos fotons. Normalment, s'utilitza un làser polsat de femtosegon, i la seva potència instantània pot arribar a l'ordre de megawatts. Per tant, la longitud d'ona de la fluorescència de dos fotons és més curta que la longitud d'ona de la llum d'excitació, que és equivalent a l'efecte produït per l'excitació a la meitat de la longitud d'ona d'excitació.
La microscòpia de fluorescència de dos fotons té molts avantatges:
1) La llum de longitud d'ona llarga es veu menys afectada per la dispersió que la llum de longitud d'ona curta i penetra fàcilment a l'exemplar;
2) Les molècules fluorescents fora del pla focal no s'exciten, de manera que més llum d'excitació pot arribar al pla focal, de manera que la llum d'excitació pugui penetrar mostres més profundes;
3) La llum propera a l'infraroig de longitud d'ona llarga és menys tòxica per a les cèl·lules que la llum de longitud d'ona curta;
4) Quan s'utilitza un microscopi de dos fotons per observar mostres, el fotoblanqueig i la fototoxicitat només es produeixen en el pla focal. Per tant, la microscòpia de dos fotons és més adequada que la microscòpia d'un sol fotó per observar exemplars gruixuts, per observar cèl·lules vives o per a experiments de fotoblanqueig puntual.
Coneixements sobre microscòpia de fluorescència confocal
El principi bàsic de la microscòpia de fluorescència confocal: la mostra s'irradia per una font de llum puntual i es forma un punt de llum petit i ben definit al pla focal. Després d'irradiar el punt, la fluorescència emesa és recollida per la lent de l'objectiu i enviada de nou al divisor de feix compost per un mirall dicroic al llarg del camí d'il·luminació original. El divisor de feix envia la fluorescència directament al detector. Hi ha un forat al davant de la font de llum i el detector, respectivament anomenat forat d'il·luminació i forat de detecció. La mida geomètrica dels dos és la mateixa, uns 100-200nm; en relació amb el punt de llum del pla focal, els dos estan conjugats, és a dir, el punt de llum passa per una sèrie de lents i, finalment, es pot enfocar al forat d'il·luminació i al forat de detecció al mateix temps. D'aquesta manera, la llum del pla focal es pot convergir dins de l'abast del forat de detecció, mentre que la llum dispersa des de dalt o per sota del pla focal es bloqueja fora del forat de detecció i no es pot visualitzar. El làser escaneja la mostra punt per punt, i el tub fotomultiplicador després de detectar el forat també obté la imatge confocal del punt de llum corresponent punt per punt, que es converteix en un senyal digital i es transmet a l'ordinador, i finalment s'agrega en una imatge clara. imatge confocal de tot el pla focal a la pantalla.
Cada imatge del pla focal és en realitat una secció transversal òptica de la mostra, i aquesta secció transversal òptica sempre té un cert gruix, també conegut com a secció prima òptica. Com que la intensitat de la llum al punt focal és molt més gran que la del punt no enfocat, i la llum del pla no focal es filtra pel forat, la profunditat de camp del sistema confocal és aproximadament zero i l'exploració al llarg del L'eix Z pot realitzar una tomografia òptica, formant una llesca òptica bidimensional al punt enfocat de la mostra a observar. Combinant l'escaneig del pla XY (pla focal) amb l'escaneig de l'eix Z (eix òptic), la imatge tridimensional de la mostra es pot obtenir acumulant imatges bidimensionals de capes contínues i processades per un programari informàtic especial.
És a dir, el forat de detecció i el forat de la font de llum sempre estan enfocats al mateix punt, de manera que la fluorescència excitada fora del pla focal no pot entrar al forat de detecció.
L'expressió senzilla del principi de funcionament del làser confocal és que utilitza llum làser com a font de llum. Sobre la base de la imatge tradicional del microscopi de fluorescència, afegeix un dispositiu d'escaneig làser i un dispositiu d'enfocament conjugat, i és un sistema d'adquisició i processament d'imatges digitals mitjançant control informàtic.
