Els microscopis de fluorescència es poden dividir en dos tipus segons el principi de la ruta òptica:
1. Microscopi de fluorescència de transmissió
Els microscopis de fluorescència més antics utilitzen un focus per excitar la fluorescència passant la font de llum d’excitació a través del material de la mostra. El seu avantatge és una forta fluorescència a baixa ampliació, però el seu desavantatge és que la seva fluorescència disminueix amb la ampliació creixent. Per tant, només és adequat per observar materials exemplars més grans.
2. Microscopi de fluorescència de la llum caient
La llum d’excitació baixa de la lent objectiva a la superfície de la mostra, utilitzant la mateixa lent objectiva que el condensador d’il·luminació i la lent objectiva per recollir fluorescència.
Cal afegir un divisor de feixos de doble color (mirall dicroic) a la ruta òptica, que forma un angle de 45 graus amb l’eix òptic. La llum d’excitació es reflecteix en la lent objectiva i es centra en la mostra. La fluorescència generada per la mostra, així com la llum d’excitació reflectida des de la superfície de la lent objectiva i el vidre de coberta, introduïu la lent objectiva alhora i torneu al divisor de feixos de doble color per separar la llum d’excitació i la fluorescència. La llum d’excitació residual es bloqueja per l’absorció del filtre. Si s’utilitzen diferents combinacions de filtres d’excitació, separadors de feixos de doble color i filtres de bloqueig, poden satisfer les necessitats de diferents productes de reacció fluorescent.
Els avantatges d’aquest microscopi de fluorescència són la il·luminació de camp uniforme, la imatge clara i la fluorescència més forta amb una ampliació més gran.
3. Microscopi de contrast de fase
El microscopi de contrast de fase és un microscopi que pot convertir la diferència de fase (o la diferència de ruta òptica) generada quan la llum passa a través d’un objecte en l’amplitud (intensitat de la llum). S'utilitza principalment per observar cèl·lules vives, seccions de teixit no tacte o exemplars tacats que no tenen contrast.
L’ull humà només pot distingir els canvis en la longitud d’ona (color) i l’amplitud de la llum visible, però no pot distingir els canvis en la fase. La majoria dels exemplars biològics són altament transparents i l'amplitud de les ones de llum es manté bàsicament inalterada després de passar, amb només canvis de fase.
El microscopi de contrast de fase converteix bàsicament la diferència de ruta òptica de la llum visible que passa a través de la mostra en diferència d’amplitud, millorant així el contrast entre diverses estructures i fent -les clares i visibles. Després de passar per l'exemplar, la llum experimenta refracció, desviant -se de la ruta òptica original i es retarda per 1/4 λ (longitud d'ona). Si la diferència de ruta òptica augmenta o disminueix en un altre 1/4 λ, la diferència de ruta òptica es converteix en 1/2 λ, i la interferència entre els dos feixos de llum augmenta o disminueix després que es combini l’eix, millorant el contrast.
