Determinació del nombre de microorganismes: el mètode de recompte directe del microscopi!
El creixement de la població bacteriana es manifesta per un augment del nombre de cèl·lules o un augment de la massa cel·lular. Els mètodes per determinar el nombre de cèl·lules inclouen el mètode de recompte directe al microscopi, el mètode de recompte de colònies de plaques, el mètode de relació d'oli fotoelèctric, el mètode de màxima probabilitat i el mètode de filtració de membrana. Els mètodes de mesura de la matèria cel·lular inclouen la determinació del pes sec cel·lular, la determinació de certs components cel·lulars com el contingut de nitrogen, ARN i ADN i la determinació de metabòlits. En resum, hi ha molts mètodes per mesurar el creixement dels microorganismes, cadascun amb els seus propis avantatges i inconvenients, i s'han de seleccionar segons la situació específica. Aquest experiment introdueix principalment el mètode de recompte directe al microscopi que s'utilitza habitualment en la producció i la investigació científica.
1. Finalitat Requisits
1. Aclarir el principi del recompte de cèl·lules sanguínies.
2. Dominar el mètode de recompte de microorganismes mitjançant un comptador de cèl·lules sanguínies.
2. Principis bàsics
El mètode de recompte directe al microscopi és un mètode senzill, ràpid i intuïtiu per comptar directament una petita quantitat de suspensió de la mostra a provar en un portaobjectes de vidre especial amb una àrea i un volum determinats (també conegut com a comptador de bacteris). Mètodes. Actualment, els comptadors de bacteris més utilitzats a casa i a l'estranger són: tauler de recompte de cèl·lules sanguínies, comptador de bacteris Peteroff-Hauser i comptador de bacteris Hawksley, etc. Es poden utilitzar per al recompte de llevats, bacteris, espores de floridura i altres suspensions, i el principi bàsic és el mateix. Els dos darrers tipus de comptadors de bacteris tenen un volum total de 0.02 mm3 després de ser coberts amb un vidre de coberta, i la distància entre el vidre de la coberta i la diapositiva és de només 0,02 mm, de manera que l'oli La lent objectiu d'immersió es pot utilitzar per observar i observar cèl·lules petites com els bacteris. comptar. A més d'aquests bacteriòmetres, també hi ha un mètode d'estimació de la relació entre l'àrea del frotis i l'àrea del camp visual observada directament al microscopi, que s'utilitza generalment per a l'examen bacteriològic de la llet. Els avantatges del mètode de comptatge directe del microscopi són intuïtius, ràpids i fàcils d'utilitzar. Tanmateix, l'inconvenient d'aquest mètode és que el resultat mesurat sol ser la suma de cèl·lules vives i mortes. Actualment, hi ha alguns mètodes per superar aquesta mancança, com ara la combinació de cultiu de microcambra de tinció de bacteris viables (poc temps) i l'addició d'inhibidors de la divisió cel·lular per aconseguir el propòsit de comptar només bacteris viables.
En aquest experiment, es va utilitzar un hemocitòmetre com a exemple per al recompte microscòpic directe. Per a l'ús dels altres dos tipus de comptadors de bacteris, consulteu les instruccions de cada fabricant. Comptar directament sota el microscopi amb un hemocitòmetre és un mètode d'ús habitual per comptar microorganismes. La placa de recompte és una diapositiva de vidre especial, sobre la qual tres plataformes estan formades per quatre ranures; la plataforma més ampla del mig està dividida en dues meitats per una ranura transversal curta i hi ha una reixeta a cada costat de la plataforma. Cada graella es divideix en nou quadrats grans, i el quadrat gran del mig és la sala de recompte. L'estructura de la placa de recompte de cèl·lules sanguínies es mostra a la figura l{{{{10}}}}. L'escala de la sala de recompte generalment té dues especificacions, una és un quadrat gran dividit en 25 quadrats mitjans i cada quadrat central es divideix en 16 quadrats petits (figura 15-2); l'altre és un gran quadrat. El quadrat es divideix en 16 quadrats mitjans, i cada quadrat central es divideix en 25 quadrats petits, però no importa quin tipus de tauler de recompte sigui, hi ha 400 quadrats petits a cada quadrat gran. La longitud lateral de cada quadrat gran és d'1 mm i l'àrea de cada quadrat gran és d'1 mm2. Després de cobrir amb un vidre de coberta, l'alçada entre el vidre de la coberta i el vidre lliscant és de 0,1 mm, de manera que el volum de la cambra de recompte és de 0,lmm3 (una mil·lèsima part de mil·lilitre). Figura 15-1 L'estructura del tauler de recompte de cèl·lules sanguínies (1) Figura 15-2 L'estructura del tauler de recompte de cèl·lules sanguínies (2) A. Vista frontal; B. Vista en secció longitudinal; La graella ampliada, el quadrat gran al mig és la cambra de recompte 1. Cèl·lules sanguínies Placa de recompte; 2. Vidre cobert; 3. Quan es compta a la cambra de recompte, normalment es compta el nombre total de bacteris en cinc quadrats, després calcula la mitjana de cada quadrat i es multiplica per 25 o 16 per obtenir El nombre total de bacteris en un quadrat gran es converteix després en el nombre total de bacteris en 1 ml de solució bacteriana. Sigui A el nombre total de bacteris dels cinc quadrats i la proporció de dilució de la solució bacteriana sigui B. Si es tracta d'una placa de recompte amb 25 quadrats, el nombre total de bacteris en 1 ml de solució bacteriana {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(peces) De la mateixa manera, si es tracta d'una placa de recompte amb 16 quadrats mitjans, el nombre total de bacteris en 1 ml de solució bacteriana=A/ 5×16×104×B=32000A·B (peces)
3. Equipament
1. Bacteris
Saccharomyces cerevisiae
2. Instruments o altres estris
Hemocitòmetre, microscopi, cobreobjectes, comptagotes capil·lar estèril.
4. Etapes de funcionament
1. Preparació de la suspensió bacteriana
Saccharomyces cerevisiae es va preparar en una suspensió bacteriana de concentració adequada amb solució salina fisiològica estèril.
2. Sala de recompte de microscopis
Abans d'afegir mostres, inspeccioneu microscòpicament la cambra de recompte de la placa de recompte. Si hi ha brutícia, s'ha de netejar i assecar abans de comptar.
3. Afegiu la mostra
Cobriu l'hemocitòmetre net i sec amb un cobreobjectes i, a continuació, utilitzeu un comptegotes capil·lar estèril per deixar caure una petita gota de la suspensió Saccharomyces cerevisiae sacsejada des de la vora del cobreobjectes i deixeu que la solució bacteriana es mogui automàticament al llarg del buit per osmosi capil·lar. Entrant a la sala de recompte, la sala de recompte general es pot omplir de líquid bacterià. Quan feu el mostreig, primer agiteu la solució bacteriana; en afegir mostres, no s'han de generar bombolles d'aire a la cambra de recompte.
4. Recompte al microscopi
Després d'afegir la mostra, romandre quiet durant 5 minuts, després col·loqueu l'hemocitòmetre a l'escenari del microscopi, primer trobeu la ubicació de la cambra de recompte amb un microscopi de baixa potència i, a continuació, canvieu a un microscopi d'alta potència per comptar. Ajusteu adequadament la intensitat de la llum del microscopi. Per als microscopis que utilitzen miralls per il·luminar, presteu atenció a no desviar-se d'un costat de la llum, en cas contrari no serà fàcil veure clarament les línies quadrades de la sala de recompte en el camp de visió, o només les línies verticals o horitzontals. ser vist. Si es constata que la solució bacteriana està massa concentrada o massa diluïda abans del recompte, cal reajustar la dilució abans del recompte. En general, la dilució de la mostra requereix uns 5 a 10 bacteris a cada cèl·lula petita. Cada cambra de recompte selecciona 5 cel·les centrals (4 cantonades opcionals i una cel·la central al centre) per comptar. Les cel·les situades a la línia de la quadrícula generalment només es compten a les línies superior i dreta. En el cas del brot del llevat, quan la mida del brot arriba a la meitat de la cèl·lula mare, es compta com a dues cèl·lules bacterianes. Per comptar una mostra, calculeu el contingut bacterià de la mostra calculant el valor mitjà de les dues cambres de recompte.
5. Rentar el recompte de cèl·lules sanguínies
Després de l'ús, esbandiu el tauler de recompte de cèl·lules sanguínies amb aigua a l'aixeta, no fregueu amb objectes durs i assequeu-lo sol o amb un assecador de cabells després del rentat. Examen microscòpic per observar si hi ha bacteris residuals o altres sediments a cada cèl·lula petita. Si no està net, s'ha de rentar repetidament fins que estigui net.
