Comparació i característiques dels microscopis de fluorescència i dels microscopis òptics convencionals
Un microscopi de fluorescència difereix d'un microscopi òptic normal. En lloc d'observar mostres amb il·luminació d'una font de llum convencional, utilitza llum d'una longitud d'ona específica (generalment llum ultraviolada o blau-violada) per excitar substàncies fluorescents dins de la mostra, fent-les emetre fluorescència. Per tant, la font de llum d'un microscopi de fluorescència no serveix per a la il·luminació directa; actua com a font d'energia per excitar substàncies fluorescents endògenes de la mostra. Podem observar la mostra no per la il·luminació de la font, sinó per la fluorescència emesa per les substàncies fluorescents de la mostra després d'absorbir la llum d'excitació.
Es dedueix que la característica clau d'un microscopi de fluorescència és la seva font de llum, que pot subministrar llum d'excitació abundant dins d'un rang de longitud d'ona específic per proporcionar una intensitat d'excitació suficient per a les substàncies fluorescents de la mostra de prova. Mentrestant, un microscopi de fluorescència ha d'estar equipat amb un sistema de filtre corresponent. Com a eina essencial per a la histoquímica de fluorescència, consisteix principalment en una font de llum d'ultra-alta pressió, un conjunt de filtres (inclosos filtres d'excitació i filtres de barrera), un sistema òptic i un sistema fotogràfic. Funciona excitant exemplars amb llum d'una certa longitud d'ona per produir fluorescència.
Mètodes d'excitació de fluorescència: classificats per rang de longitud d'ona en excitació UV (mètode d'il·luminació ultraviolada) i excitació BV (mètode de llum blava-violada). L'excitació UV utilitza llum gairebé ultraviolada de menys de 400 nm per a l'excitació. No hi ha cap llum d'excitació visible, de manera que la fluorescència observada mostra la fluorescència inherent del colorant. Això fa que sigui fàcil distingir la fluorescència específica de la mostra de l'autofluorescència del teixit de fons.
Mètode d'excitació BV: l'excitació es realitza amb llum que va des de la llum ultraviolada fins a la blava, centrada a 404 nm i 434 nm. Com que la llum blava irradia la mostra en aquest mètode, el filtre de tall del sistema d'observació de fluorescència ha de bloquejar completament la llum blava mentre transmet completament la fluorescència verda i groga necessària. Aquest mètode s'aplica als fluorocroms utilitzats en tècniques d'anticossos fluorescents. La longitud d'ona màxima d'absorció de la llum d'excitació i la longitud d'ona màxima d'emissió de la fluorescència són relativament properes, de manera que es necessiten filtres de tall agut per a l'excitació de BV. Aquí s'utilitza la llum blava com a llum d'excitació, que aporta una alta eficiència d'absorció dels fluorocroms i produeix imatges més brillants. El seu inconvenient és que la fluorescència per sota de 500 nm no es pot detectar, i els senyals per sobre de 500 nm donen a tota la imatge un to groc. En els assaigs d'anticossos fluorescents, l'especificitat es jutja principalment pel color característic del fluorocrom. Per tant, quan s'avalua l'especificitat subtil, el desavantatge anterior del mètode d'excitació BV pot tenir un impacte significatiu.
