Avantatges de les millores per als microscopis multifotònics d'escaneig làser
Els microscopis multifotòns d'escaneig làser representen un gran avenç en la microscòpia òptica. Principalment són capaços d'observar estructures profundes de cèl·lules vives, cèl·lules fixes i teixits, i adquirir estructures de plànol Z multicapa nítides i clares, és a dir, seccions òptiques, que es poden utilitzar per reconstruir l'estructura sòlida tridimensional dels exemplars.
Un microscopi confocal utilitza una font de llum làser. El feix làser expandit omple tot el pla focal posterior de la lent de l'objectiu i després passa pel sistema de lents de l'objectiu per convergir en un punt extremadament petit al pla focal de la mostra. Depenent de l'obertura numèrica de la lent de l'objectiu, el diàmetre del punt il·luminat és d'aproximadament 0,25-0,8 μm, amb una profunditat d'uns 0,5-1,5 μm. La mida del punt confocal es determina pel disseny del microscopi, la longitud d'ona del làser, les característiques objectives, la configuració dels paràmetres de la unitat d'escaneig i les propietats de la mostra.
Els microscopis de camp ample presenten una gran àrea d'il·luminació i una profunditat d'il·luminació profunda, mentre que la il·luminació dels microscopis confocals es concentra en un petit punt focal del pla focal. L'avantatge fonamental dels microscopis confocals és que poden realitzar una secció òptica fina en mostres fluorescents gruixudes (fins a 50 μm o més), amb un gruix de secció que oscil·la entre 0,5 i 1,5 μm. Es poden obtenir una sèrie d'imatges de secció òptica movent la mostra verticalment mitjançant el motor pas a pas de l'eix Z del microscopi. L'adquisició d'imatges es limita al pla seleccionat i no es veurà pertorbada pels senyals emesos des d'altres regions de la mostra. Després d'eliminar la fluorescència de fons i millorar la relació senyal-soroll, les imatges confocals presenten un contrast i una resolució notablement més alts en comparació amb les imatges de fluorescència de camp ampli convencionals.
En molts exemplars, nombrosos components estructurals intricats s'entrellacen per formar sistemes complexos. Un cop adquirides les imatges de secció òptica suficients, es pot realitzar una reconstrucció tridimensional mitjançant programari. Aquest mètode experimental s'ha aplicat àmpliament en la investigació biològica per dilucidar les complexes relacions estructurals i funcionals entre cèl·lules o teixits.
