Quins són els components estructurals especials d'un microscopi fluorescent?
El bloc de filtre de color és una part important d'un microscopi de fluorescència i els seus components bàsics consisteixen en un primer filtre de barrera per a la llum d'excitació, un segon filtre de barrera per a la llum d'emissió i un mirall de divisió del feix. Els models de filtre de color i els noms de diversos fabricants sovint són inconsistents.
1. Filtre de llum d'excitació i filtre de llum d'emissió: en funció de les característiques de la font de llum i del pigment fluorescent, se solen seleccionar els tres tipus de concordança següents per proporcionar llum d'excitació dins d'un determinat rang de longitud d'ona i permetre que la fluorescència excitada per la mostra passi i arribi a l'ocular per a la imatge.
Excitació UV: el filtre de llum d'excitació pot permetre que la llum UV passi i bloqueja la llum visible per sobre de 400 nm. El filtre de llum d'emissió corresponent permet que la llum blava passi i la llum del camp de visió apareix blava, com quan s'aplica a la tinció DAPI.
Excitació de llum blava: el filtre de llum d'excitació pot permetre que la llum blava passi i bloqueja la llum d'altres longituds d'ona. El filtre de llum d'emissió corresponent permet que passi la llum verda, com ara els marcadors de tinció de GFP.
Excitació de llum verda: el filtre de llum d'excitació permet que la llum verda passi i bloqueja la llum d'altres longituds d'ona. El filtre de llum d'emissió corresponent acostuma a deixar passar la llum vermella, com ara la tinció de rodamina.
2. Filtre de color semitransparent i semi reflectant: la seva funció és bloquejar completament el pas de la llum d'excitació i reflectir-la; I emeten llum dins del rang de longitud d'ona corresponent. El seu model correspon al filtre de llum d'excitació i al filtre de llum d'emissió.
(2) Objectiu i ocular
Es poden aplicar diverses lents objectives, però el millor és triar lents amb escala addicional i reducció de l'aberració cromàtica, ja que la seva autofluorescència és extremadament baixa i el seu rendiment de transmissió de llum (rang de longitud d'ona) és adequat per a la fluorescència. A causa del fet que la brillantor de fluorescència d'una imatge en el camp del microscopi és directament proporcional al quadrat de la relació d'obertura de la lent objectiu i inversament proporcional a la seva ampliació, per tal de millorar la brillantor de les imatges de fluorescència, s'ha d'utilitzar una lent objectiu amb una relació d'obertura més gran. Especialment per a mostres amb una fluorescència insuficient, s'ha d'utilitzar una lent objectiu amb una alta relació d'obertura i una alta transmissió de la llum, acompanyada d'un ocular amb el menor augment possible.
(3) Altres dispositius òptics
La capa reflectant d'un mirall sol estar recoberta d'alumini perquè l'alumini absorbeix menys llum ultraviolada i visible a la regió blava porpra, reflectint més del 90% (mentre que la plata només té una reflectivitat del 70%). En general, s'utilitzen miralls plans. La lent d'enfocament, dissenyada i fabricada específicament per a microscopis de fluorescència, està feta de vidre de quars o un altre vidre que transmet la llum ultraviolada. El dispositiu de llum caiguda, a més de tenir la funció de font de llum transmissiva, és més adequat per a l'observació directa d'exemplars opacs i semitransparents, com ara plaques gruixudes, membranes de filtre, colònies bacterianes, cultius de teixits i altres mostres. En els darrers anys, s'han desenvolupat molts nous tipus de microscopis de fluorescència mitjançant un dispositiu de llum caiguda, conegut com a microscopi de fluorescència de caiguda.
(4) Font de llum
Actualment, les làmpades de mercuri d'alta pressió de 50 o 100 W s'utilitzen habitualment com a fonts de llum. Durant el funcionament, la descàrrega es produeix entre dos elèctrodes, fent que el mercuri s'evapori i que la pressió dins de l'esfera augmenti ràpidament (aquest procés sol durar uns 5-15 minuts). Durant aquest procés, s'emeten quants de llum i la longitud d'ona de la llum alliberada és suficient per excitar diverses substàncies fluorescents. Per tant, s'utilitza àmpliament en microscopis de fluorescència.
La vida útil de les làmpades de mercuri és relativament curta, normalment 200 hores. Com a resposta a aquesta limitació de la vida útil, en els darrers anys, s'ha utilitzat àmpliament un nou tipus de font de llum fluorescent X-Cite amb una vida útil de la bombeta molt llarga de 2000 hores i un ús flexible - sense necessitat de preescalfament, llest per utilitzar.
