La microscòpia de fluorescència de dos fotons té molts avantatges
1) La llum de longitud d'ona llarga es veu menys afectada per la dispersió que la llum de longitud d'ona curta i pot penetrar fàcilment a l'exemplar;
2) Les molècules fluorescents fora del pla focal no s'exciten, permetent que més llum d'excitació arribi al pla focal, permetent que la llum d'excitació penetri en mostres més profundes;
3) La llum propera a l'infraroig de longitud d'ona llarga és menys tòxica per a les cèl·lules que la llum de longitud d'ona curta;
4) Quan s'observen mostres amb un microscopi de dos fotons, el fotoblanqueig i la fototoxicitat només es produeixen al pla focal. Per tant, els microscopis de dos fotons són més adequats que els microscopis d'un sol fotó per observar mostres gruixudes, per observar cèl·lules vives o per realitzar experiments de fotoblanqueig de punt fix.
Coneixements sobre microscòpia de fluorescència confocal
El principi bàsic de la microscòpia de fluorescència confocal: utilitzeu una font de llum puntual per il·luminar l'exemplar per formar un punt de llum petit i ben definit al pla focal. La fluorescència emesa pel punt després de ser il·luminada és recollida per la lent de l'objectiu i retornada al mirall dicroic al llarg del camí de la llum d'il·luminació original. constitueixen un divisor de feix. L'espectròmetre envia la fluorescència directament al detector. Hi ha un forat al davant de la font de llum i del detector, que s'anomenen forat d'il·luminació i forat de detecció respectivament. Les dimensions geomètriques dels dos són consistents, aproximadament 100-200nm; en relació al punt de llum del pla focal, els dos estan conjugats, és a dir, el punt de llum passa per una sèrie de lents i, finalment, es pot enfocar al forat d'il·luminació i al forat de detecció al mateix temps. D'aquesta manera, la llum del pla focal es pot concentrar dins del forat de detecció, mentre que la llum dispersa des de dalt o per sota del pla focal es bloqueja fora del forat de detecció i no es pot fer imatges. La mostra s'escaneja punt per punt amb el làser, i el tub fotomultiplicador darrere del forat de detecció també obté la imatge confocal del punt de llum corresponent punt per punt, que es converteix en un senyal digital i es transmet a l'ordinador, i finalment s'agrega. a la pantalla en una imatge confocal clara de tot el pla focal. .
Cada imatge del pla focal és en realitat una secció transversal òptica de la mostra. Aquesta secció transversal òptica sempre té un cert gruix i també s'anomena secció prima òptica. Com que la intensitat de la llum al focus és molt més gran que la intensitat de la llum al no enfocat, i la llum del pla no focal es filtra pel forat, la profunditat de camp del sistema confocal és aproximadament zero. L'escaneig al llarg de la direcció de l'eix Z pot realitzar una tomografia òptica, formant el desitjat Observeu la secció òptica bidimensional al punt enfocat de la mostra. Combinant l'exploració del pla XY (pla focal) amb l'escaneig de l'eix Z (eix òptic), acumulant nivells continus d'imatges bidimensionals i processant-les amb programari informàtic especialitzat, es pot obtenir una imatge tridimensional de la mostra.
És a dir, el forat de detecció i el forat de la font de llum sempre estan enfocats al mateix punt, de manera que la fluorescència excitada fora del pla de focus no pot entrar al forat de detecció.
L'expressió senzilla del principi de funcionament del làser confocal és que utilitza làser com a font de llum. Sobre la base de la imatge tradicional del microscopi de fluorescència, s'afegeix un dispositiu d'escaneig làser i un dispositiu d'enfocament conjugat, i el sistema està controlat per un ordinador per recollir i processar imatges digitals.
