El principal mètode d'observació del microscopi òptic és l'observació de fluorescència
La fluorescència fa referència al procés en què una substància fluorescent emet llum amb una longitud d'ona més llarga gairebé simultàniament quan s'irradia amb llum d'una longitud d'ona específica (Figura 1). Quan la llum d'una longitud d'ona específica (longitud d'ona d'excitació) colpeja una molècula, com les d'un fluoròfor, l'energia del fotó és absorbida pels electrons de la molècula. A continuació, els electrons passen de l'estat fonamental (S0) a un nivell d'energia més alt, l'estat excitat (S1'). Aquest procés s'anomena excitació①. L'electró es manté en estat excitat durant 10-9–{10-8 segons, durant els quals l'electró perd una mica d'energia②. Durant el procés dels electrons que surten de l'estat excitat (S1) i tornen a l'estat fonamental③, s'allibera l'energia restant absorbida durant el procés d'excitació.
El temps de residència de la molècula fluorescent en estat excitat és la vida útil de la fluorescència, que generalment es troba al nivell de nanosegons, i és una característica inherent a la pròpia molècula fluorescent. La fluorescència per a la vida d'imatges (FLIM), que utilitza la tecnologia d'imatge de fluorescència de per vida, s'anomena imatge de fluorescència de per vida (FLIM). A més de la imatge d'intensitat de fluorescència, es poden obtenir mesures funcionals i precises més profundes per obtenir la conformació molecular, les interaccions intermoleculars i el microentorn de les molècules. Informació difícil d'obtenir amb la imatge òptica convencional.
Una altra propietat important de la fluorescència és el desplaçament de Stokes, la diferència de longitud d'ona entre els pics d'excitació i d'emissió (figura 2). Normalment, la longitud d'ona d'emissió és més llarga que la longitud d'ona d'excitació. Això es deu al fet que els electrons perdran part de la seva energia a través del procés de relaxació després d'excitar la substància fluorescent i abans d'alliberar fotons. Les substàncies fluorescents amb desplaçaments de Stokes més grans són més fàcils d'observar amb un microscopi de fluorescència.
Microscòpia de fluorescència i cubs de filtre de fluorescència
El microscopi de fluorescència és un microscopi òptic que utilitza propietats de fluorescència per a l'observació i la imatge, i s'utilitza àmpliament en diversos camps com ara la biologia cel·lular, la neurobiologia, la botànica, la microbiologia, la patologia i la genètica. La imatge de fluorescència té els avantatges d'una alta sensibilitat i alta especificitat, i és molt adequada per a l'observació de la distribució de proteïnes i orgànuls específics en teixits i cèl·lules, l'estudi de la colocalització i la interacció, el seguiment de processos dinàmics de la vida com els canvis de concentració d'ions. , etc.
La majoria de molècules de les cèl·lules no fan fluorescència, i per veure-les s'han d'etiquetar fluorescentment. Hi ha molts mètodes d'etiquetatge fluorescent, com ara l'etiquetatge directe (com l'ús de DAPI per etiquetar l'ADN), o la immunotinció utilitzant les propietats d'unió a l'antigen dels anticossos, o l'ús de proteïnes fluorescents (com ara GFP, proteïna fluorescent verda) per etiquetar proteïnes diana. , i enquadernació reversible. Tints sintètics (com ara Fura-2) i així successivament.
Actualment, el microscopi de fluorescència s'ha convertit en l'equip d'imatge estàndard de diversos laboratoris i plataformes d'imatge, i és un bon ajudant per als nostres experiments diaris. Els microscopis de fluorescència es divideixen principalment en tres categories: microscopis de fluorescència verticals (aptes per tallar), microscopis de fluorescència invertida (adequats per a cèl·lules vives, tenint en compte el tall), estereoscopis fluorescents (adequats per a exemplars més grans, com ara plantes, peix zebra (adult/embrió). ), medaka, òrgans de ratolí/rata, etc.).
El bloc de filtre de fluorescència és el component bàsic de la imatge de fluorescència del microscopi. Consta de tres parts: filtre d'excitació, filtre d'emissió i divisor de feix dicroic. S'instal·la a la roda del filtre. Per exemple, el Leica DMi8 està equipat amb una 6-roda de filtre de posició (Fig. 3). El nombre de posicions de diferents rodes de microscopi serà diferent i alguns microscopis utilitzen diapositives de bloc de filtres.
El bloc de filtre té un paper important en la imatge de fluorescència: el filtre d'excitació selecciona la llum d'excitació per excitar la mostra i bloqueja la llum d'altres longituds d'ona; la llum que passa pel filtre d'excitació passa pel mirall dicroic (la seva funció és reflectir la llum d'excitació i transmetre la fluorescència), després de la reflexió, s'enfoca per la lent objectiu, irradia la mostra i excita la fluorescència corresponent, és a dir , llum emesa. La llum emesa és recollida per la lent de l'objectiu, passa pel divisor de feix dicroic i arriba al filtre d'emissió. Com es mostra a la figura 4: la longitud d'ona d'excitació és de 450-490 nm, el mirall dicroic reflecteix la llum més curta que 510 nm, transmet llum més llarga que 510 nm i el rang de recepció de la llum emesa és de 520-560 nm.
