El principal mètode d'observació del microscopi òptic és l'observació de fluorescència
Fenomen de fluorescència
La fluorescència es refereix al procés en què una substància fluorescent emet llum amb una longitud d'ona més llarga gairebé simultàniament quan s'irradia amb llum d'una longitud d'ona específica (figura 1). Quan la llum d'una longitud d'ona específica (longitud d'ona d'excitació) colpeja una molècula (com una molècula d'un fluoròfor), l'energia del fotó és absorbida pels electrons de la molècula. A continuació, els electrons passen de l'estat fonamental (S0) a un nivell d'energia més alt, l'estat excitat (S1'). Aquest procés s'anomena excitació①. L'electró es manté en estat excitat durant 10-9–{10-8 segons, durant els quals l'electró perd una mica d'energia ②. En el procés de sortir de l'estat excitat (S1) i tornar a l'estat fonamental ③, s'alliberarà l'energia restant absorbida durant el procés d'excitació.
El temps de residència d'una molècula fluorescent en estat excitat és el temps de vida de la fluorescència, generalment en nanosegons, que és una característica inherent de la pròpia molècula fluorescent. La tecnologia d'imatge que utilitza la vida útil de la fluorescència s'anomena Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), que pot realitzar mesures funcionals i precises més profundes a més de la imatge d'intensitat de fluorescència per obtenir conformació molecular, interaccions intermoleculars i microambients moleculars. informació que és difícil d'obtenir amb imatges òptiques convencionals.
Una altra propietat important de la fluorescència és el desplaçament de Stokes, la diferència de longitud d'ona entre els pics d'excitació i d'emissió (figura 2). En general, la longitud d'ona de la llum d'emissió és més llarga que la longitud d'ona de la llum d'excitació. Això es deu al fet que després d'excitar la substància fluorescent i abans que s'alliberi el fotó, els electrons perdran una part de l'energia a través del procés de relaxació. Les substàncies fluorescents amb desplaçaments de Stokes més grans són més fàcils d'observar amb un microscopi de fluorescència.
Microscopis de fluorescència i blocs de filtres de fluorescència
La microscòpia de fluorescència és un microscopi òptic que utilitza propietats de fluorescència per observar i imatge, i s'utilitza àmpliament en biologia cel·lular, neurobiologia, botànica, microbiologia, patologia, genètica i altres camps. La imatge de fluorescència té els avantatges d'una alta sensibilitat i alta especificitat, i és molt adequada per a l'observació de la distribució de proteïnes específiques, orgànuls, etc. en teixits i cèl·lules, l'estudi de la colocalització i la interacció i el seguiment de la dinàmica de la vida. processos com els canvis en la concentració d'ions.
La majoria de molècules de les cèl·lules no fan fluorescència i, per veure-les, s'han d'etiquetar amb fluorescència. Hi ha molts mètodes d'etiquetatge fluorescent, que es poden marcar directament (com ara utilitzar DAPI per etiquetar l'ADN), o immunotinció utilitzant les propietats d'unió a l'antigen dels anticossos, o la proteïna diana es pot etiquetar amb proteïnes fluorescents (com ara GFP, verd). proteïna fluorescent) o unió reversible. tints sintètics (com ara Fura-2), etc.
Actualment, el microscopi de fluorescència s'ha convertit en l'equip d'imatge estàndard de diversos laboratoris i plataformes d'imatge, i és un bon ajudant per als nostres experiments diaris. Els microscopis de fluorescència es divideixen principalment en tres categories: microscopis de fluorescència verticals (aptes per seccionar), microscopis de fluorescència invertida (adequats per a cèl·lules vives, tenint en compte les seccions), microscopis estereoscòpics fluorescents (adequats per a exemplars més grans, com ara plantes, peixos zebra (adults/ embrió), medaka, òrgans de ratolí/rata, etc.).
El bloc de filtre de fluorescència és el component bàsic de la imatge de fluorescència als microscopis. Consta d'un filtre d'excitació, un filtre d'emissió i un divisor de feix dicroic. S'instal·la a la roda de filtres, com ara el Leica DMi8 equipat amb una 6-roda de filtres de posició (figura 3). ). Els diferents microscopis tenen diferents posicions de les rodes i alguns microscopis utilitzen diapositives de filtre.
El bloc de filtre té un paper important en la imatge de fluorescència: el filtre d'excitació selecciona la llum d'excitació per excitar la mostra i bloqueja altres longituds d'ona de llum; la llum que passa pel filtre d'excitació passa a través d'un divisor de feixos dicroic (la seva funció és reflectir la llum d'excitació i transmetre la fluorescència), després de la reflexió, la lent objectiu s'enfoca, s'irradia a la mostra i la fluorescència corresponent s'excita a emetre llum. La llum emesa és recollida per la lent de l'objectiu, passa pel divisor de feix dicroic i arriba al filtre d'emissió. Com es mostra a la figura 4: la longitud d'ona d'excitació és de 450-490 nm, el divisor de feix dicroic reflecteix la llum més curta que 510 nm, transmet llum més llarga que 510 nm i el rang de recepció de la llum d'emissió és de 520-560 nm.
Els filtres de fluorescència que s'utilitzen habitualment als microscopis de fluorescència es poden dividir en dos tipus: de pas llarg (LP per a curt) i de pas de banda (BP per abreujar). El pas de banda normalment es determina per la longitud d'ona central i l'amplada de l'interval, com ara 480/40, el que significa que es pot passar llum de 460-500nm. Els filtres de pas llarg, com ara 515 LP, passen la llum amb longituds d'ona superiors a 515 nm (figura 5).
Les substàncies fluorescents tenen la seva corba d'excitació (absorció) i corba d'emissió característiques, el pic d'excitació és la longitud d'ona d'excitació ideal (alta eficiència d'excitació, que pot reduir l'energia de la llum d'excitació, protegir les cèl·lules i els colorants), i la corba d'emissió és la longitud d'ona de fluorescència d'emissió. rang. Per tant, a l'experiment, triarem la longitud d'ona el més propera possible al pic d'excitació per a l'excitació, i el rang de recepció ha d'incloure el pic d'emissió. Per exemple, el pic d'excitació de l'Alexa Fluor 488 és de 500 nm i el filtre d'excitació de 480/40 es pot seleccionar al microscopi de fluorescència.
Els detalls dels cubs de filtre es poden veure al programari d'imatge del microscopi. Entendre els colorants i trobar el filtre que millor s'adapti a la vostra mostra és fonamental per a la imatge de fluorescència. La informació espectral de colorants fluorescents i proteïnes fluorescents s'indica generalment a les instruccions, i també es pot trobar en línia.
A més de les longituds d'ona d'excitació i emissió de les sondes fluorescents, la selecció de blocs de filtre també ha de considerar si hi ha excitació no específica i si hi ha un color creuat per a mostres marcades multicolors. A més, cal tenir en compte la font de llum fluorescent utilitzada. Actualment, les fonts de llum fluorescents que s'utilitzen habitualment inclouen làmpades de mercuri, làmpades d'halogenurs metàl·lics i fonts de llum LED que s'han desenvolupat ràpidament en els darrers anys. L'espectre d'una font de llum fluorescent és continu o discontinu, i l'energia serà diferent en diferents bandes de longitud d'ona. La font de llum LED s'està convertint gradualment en la principal font de llum del microscopi de fluorescència a causa de la seva banda espectral relativament estreta, producció d'energia més estable, llarga vida, protecció més segura i mediambiental i molts altres avantatges.
A més del bloc de filtres integrat del microscopi, també hi ha una roda ràpida externa (Figura 7). La velocitat de conversió del filtre adjacent a la roda ràpida externa de Leica és de 27 ms, que pot realitzar experiments multicolors d'alta velocitat, com ara imatges de calci de proporció FRET i Fura2. (Fig. 8) et al.
Una àmplia varietat de tècniques d'imatge amb microscòpia de fluorescència
Per tal de satisfer les diferents necessitats d'imatge de fluorescència, a més dels microscopis de fluorescència, s'han desenvolupat diverses solucions d'imatge de microscòpia de fluorescència:
Els sistemes d'imatge d'alta definició de camp ampli, com el Leica THUNDER Imager, utilitzen la innovadora tecnologia Clearing de Leica per eliminar de manera eficient els senyals d'interferència del pla no focal durant la imatge, presentant imatges clares i els avantatges de la imatge d'alta velocitat;
El microscopi d'exploració làser confocal utilitza forats per eliminar la interferència del pla no focal, realitza seccions òptiques i obté imatges d'alta definició i imatges tridimensionals;
Els microscopis d'ultra alta resolució i els nanomicroscopis que superen el límit de difracció poden observar estructures fines de menys de 200 nm;
Un sistema d'imatge multifotòn que utilitza el principi d'excitació multifotònica per a la imatge de teixit gruixut i profund in vivo;
Tecnologia d'imatge de fulls lleugers amb alta resolució temporal i espacial, velocitat d'imatge ràpida, alta resolució, baixa fototoxicitat, especialment adequada per a la investigació sobre desenvolupament i observació dinàmica in vivo;
La imatge de vida útil de fluorescència (FLIM), que no es veu afectada per factors com la concentració de substàncies fluorescents, el fotoblanqueig, la intensitat de la llum d'excitació, etc., poden realitzar mesures funcionals i precises més profundes;
L'espectroscòpia de correlació de fluorescència (FCS) i l'espectroscòpia de correlació creuada de fluorescència (FCCS), mesuren el nombre molecular i el coeficient de difusió de les molècules fluorescents, analitzant així la concentració molecular, la mida molecular, la viscositat, el moviment molecular, la unió / dissociació molecular i les propietats òptiques moleculars;
La microscòpia de fluorescència de reflexió interna total (TIRF), amb una resolució de l'eix z extremadament alta, és ideal per estudiar l'estructura molecular i la dinàmica de les superfícies de la membrana cel·lular.
