La diferència entre el microscopi de fluorescència (dos fotons, confocals) i el microscopi ordinari
El principi bàsic de l’excitació de dos fotons és que a alta densitat de fotons, les molècules fluorescents poden absorbir simultàniament dos fotons de longitud d’ona llarga i emetre un fotó de longitud d’ona més curt després d’un curt període d’anomenada vida excitat de tota la vida; L’efecte és el mateix que utilitzar un fotó amb la meitat de la longitud d’ona de la longitud d’ona llarga per excitar molècules fluorescents. Dues excitació de fotons requereix una alta densitat de fotons i, per evitar cèl·lules danyades, la microscòpia de dos fotons utilitza làsers de pols bloquejats en mode d’alta energia. El làser emès per aquest làser té alta energia màxima i baixa energia mitjana, amb una amplada de pols de només 100 femtosegons i una freqüència de fins a 80 a 100 megahertz. Quan s’utilitza una lent d’objectiu d’obertura numèrica elevada per centrar els fotons d’un làser polsat, la densitat de fotons en el punt focal de la lent objectiva és la més alta i l’excitació de dos fotons només es produeix en el punt focal de la lent objectiva. Per tant, el microscopi de dos fotons no requereix un forat confocal, que millora l'eficiència de la detecció de fluorescència.
En generals fenòmens de fluorescència, a causa de la baixa densitat de fotons de la llum d’excitació, una molècula fluorescent només pot absorbir un fotó alhora i després emetre un altre fotó fluorescent mitjançant transició radiativa, que es coneix com a fluorescència d’un fotó únic. Per als processos d’excitació de fluorescència que utilitzen làsers com a fonts de llum, es poden produir fenòmens de fluorescència de dos fotons o fins i tot multiphotons. En aquest cas, la font de llum d’excitació utilitzada té una alta intensitat i densitat de fotons que compleix el requisit de molècules fluorescents per absorbir dos fotons simultàniament. En el procés d’utilitzar un làser general com a font de llum d’excitació, la densitat de fotons encara és insuficient per produir fenomen d’absorció de dos fotons. Típicament, s’utilitzen làsers de pols femtosegona, amb potència instantània assolint el nivell de megavati. Per tant, la longitud d’ona de la fluorescència de dos fotons és menor que la de la llum d’excitació, equivalent a l’efecte produït per la mitja excitació d’excitació d’ona.
Coneixement relacionat amb la microscòpia de fluorescència confocal
El principi bàsic de la microscòpia de fluorescència confocal és utilitzar una font de llum puntual per irradiar la mostra, formant un punt de llum petit ben definit al pla focal. La fluorescència emesa des d’aquest lloc després de la irradiació es recopila per la lent objectiva i s’envia de nou al llarg del camí d’irradiació original al divisor del feix compost per un mirall dicroic. L’espectròmetre envia la fluorescència directament al detector. Hi ha un forat davant de la font de llum i del detector, anomenat forat d’il·luminació i el forat de detecció, respectivament. Les dimensions geomètriques dels dos són consistents, aproximadament 100-200 nm; En comparació amb el punt de llum del pla focal, els dos són conjugats, el que significa que el punt de llum passa per una sèrie de lents i, finalment, es pot centrar tant en el forat d’il·luminació com en el forat de detecció simultàniament. D’aquesta manera, la llum del pla focal pot convergir dins del rang del forat de detecció, mentre que la llum dispersa des de dalt o per sota del pla focal es bloqueja fora del forat de detecció i no es pot imaginar. Escanejant el punt de mostra per punt amb un làser, el tub fotomultiplicador després de detectar el forat també obté la imatge confocal corresponent del punt de llum per punt, el converteix en un senyal digital i el transmet a l’ordinador i, finalment, l’agrega en una imatge confocal clara de tot el pla focal de la pantalla.
