La diferència entre el contrast de fase positiu i negatiu en un microscopi
Depenent de la configuració i la naturalesa de l'anell de fase situat al pla focal posterior de l'objectiu, les mostres es poden observar en contrast de fase positiu o negatiu. Aquest tutorial interactiu estudia la relació entre l'entorn (S), la difracció (D) i les partícules brillants resultants (ones P), així com la microscòpia de contrast de fase positiva i negativa. A més, també es presenta la geometria de la placa de fase i imatges de mostra representatives.
Quan la gent l'utilitza en el seu treball ara, la majoria dels investigadors es troben en la diferència negativa, i ara la diferència positiva no juga gaire paper en el treball de recerca científica actual.
El tutorial inicialitza la imatge de fase amb una mostra seleccionada aleatòriament que apareix a la finestra Imatge de contrast de fase, i la relació d'ona corresponent es mostra al veí esquerre de la finestra de la imatge. Per fer servir el tutorial, utilitzeu el cursor del ratolí per moure la traducció entre el contrast de fase positiu i negatiu o el control lliscant del mode de contrast de fase d'il·luminació brillant. Quan es tradueix el control lliscant, les imatges que apareixen a la finestra d'imatge de contrast de fase canvien com apareix l'exemplar en el mode d'imatge actual establert pel control lliscant. A més, a sota del gràfic de la forma d'ona hi ha una placa de fase que canvia de forma perquè coincideixi amb el mode d'imatge seleccionat pel control lliscant. Per veure una mostra nova, utilitzeu el menú desplegable Mostra seleccionada per seleccionar una altra mostra.
A la figura 1 es presenta un gràfic de la configuració de la placa de fase, les relacions d'ona i els vectors associats a la generació d'imatges de contrast de fase positives i negatives. També es mostren exemples d'exemplars capturats amb aquestes tècniques. En una configuració òptica de contrast de fase positiu (fila superior de la imatge de la figura 1), el front d'ona envoltant (S) passa per la placa de fase, donant lloc a un canvi de fase net d'avançament de fase de 180 graus, en 1/4 de longitud d'ona ( 1 mitja longitud d'ona). Els fronts d'ona envoltant avançats ara poden participar en la interferència destructiva amb ones difractades (D) al pla de la imatge intermedi. En la majoria dels casos, només avançar la fase relativa del front d'ona circumdant no és suficient per generar imatges d'alt contrast als microscopis Nikon. Això es deu al fet que l'amplitud de les ones envoltants és significativament més gran que la de les ones difractades i suprimeix la imatge resultant produïda per la interferència d'una fracció del nombre total d'ones. Per tal de reduir el front d'ona circumdant a un valor més proper a l'amplitud de les ones difractades (i realitzar interferències en el pla de la imatge), l'opacitat a l'anell de fase de l'objectiu s'obté aplicant un metall semitransparent (densitat creixent neutra). ) Revestiment de terra. Les ones de llum circumdants, que passen gairebé completament a través de l'anell de fase per disseny, sota microscòpia de contrast de fase, es redueixen significativament en amplitud per l'opacitat de la placa de fase a un valor en el rang del 10 al 30 per cent de la intensitat original.
Com que l'ona de partícules resultant es produeix per la interferència* dels fronts d'ona circumdants i difractats, l'amplitud de l'ona de partícules (P) produïda per la interferència entre els fronts d'ona que arriben al pla de la imatge és ara molt més petita que la que l'envolta quan està en Sexual. recobriment de densitat aplicat. L'efecte net és convertir la diferència de fase relativa introduïda pel pas de la llum que emergeix del pla de la imatge a través de l'exemplar en una diferència d'amplitud (intensitat). Com que l'ull humà interpretarà la diferència d'intensitat com un contrast, la mostra és ara visible a l'ocular del microscopi i també es pot capturar a la membrana amb sistemes de càmeres convencionals, o digitalment, mitjançant dispositius CCD o CMOS. Tots els sistemes de contrast de fase positiva avancen selectivament la fase del front d'ona envoltant lineal (S) en relació amb el front d'ona difractat esfèric (D). Els exemplars amb un índex de refracció més alt que el medi circumdant apareixen més foscos sobre un fons gris neutre, mentre que aquells amb un índex de refracció més baix que el medi de natació semblen més brillants que el fons gris.
Per tal de modificar la separació espacial dels fronts d'ona difractats que envolten la fase i l'amplitud en un sistema òptic de contrast de fase, s'han introduït una sèrie de configuracions de plaques de fase. Com que la placa de fases està situada o molt a prop del pla focal posterior de l'objectiu (pla de difracció), tota la llum que passa pel microscopi ha de viatjar a través d'aquest component. La part de la placa de fase en el seu focus anular del condensador s'anomena regió conjugada, mentre que la regió restant s'anomena regió complementària. La regió conjugada conté el material responsable de canviar la fase de la llum circumdant (no difractada) en 90 graus més o menys respecte al front d'ona difractat. En general, l'àrea de l'anell conjugat de fase és més àmplia (aproximadament un 25 per cent) que l'àrea definida per la imatge de l'anell de condensació per reduir la quantitat de llum circumdant que es propaga a l'àrea complementària.
La majoria de plaques de fase disponibles dels fabricants de microscopis moderns són una de les preparades mitjançant la deposició al buit de pel·lícules fines dielèctriques i metàl·liques sobre una placa de vidre o muntades directament a la superfície de la lent de l'objectiu del microscopi. El paper de la pel·lícula dielèctrica és posar en fase la llum, mentre que la pel·lícula metàl·lica atenua la intensitat de la llum no difractada. Alguns fabricants utilitzen múltiples recobriments antireflectants combinats amb la pel·lícula per reduir la quantitat d'enlluernament i la reflexió de la llum dispersa al sistema òptic. Si la placa de fase no es forma a la superfície d'una lent, normalment es cimenta entre lents successives que resideixen en el pla focal prop de la part posterior de l'objectiu. El gruix i l'índex de refracció dels recobriments dielèctrics, metàl·lics i antireflectants, així com els del ciment òptic, s'escullen amb cura per produir el canvi de fase desitjat entre les regions complementàries i conjugades de la placa de fase. En termes òptics, una placa de fase que canvia la fase relativa a la llum circumdant per difractar la llum en 90 graus (positiu o negatiu) s'anomena placa de quart d'ona a causa de l'efecte de diferència del camí òptic sobre ella.
A la figura 1 es mostra una visió general de la fase positiva inversa. La placa de contrast de fase positiva (costat esquerre de la figura 1) impulsa l'ona envoltant, en 1/4 de longitud d'ona, a causa de l'anell d'erosió de la placa de vidre, que pot ser reduït pel pas superior a la placa d'índex alt La trajectòria física de l'ona presa. A causa de la interacció amb la mostra, quan els raigs de mostra difractats (D) es retarden, la diferència de camí òptic entre les ones circumdants i difractades que emergeixen de la placa de fase és de mitja longitud d'ona per 1/4 de longitud d'ona. El resultat net és una diferència de camí òptic de 180-graus entre les ones circumdants i difractades, que provoca una interferència destructiva per a mostres d'índex de refracció alt entre els plans de la imatge. La corba d'amplitud de la fase positiva oposada a l'ona d'interferència destructiva es mostra al gràfic superior de la figura 1. L'ona de partícules (P) resultant té una amplitud més baixa que l'ona envoltant (S), fent que l'objecte aparegui en comparació amb una ona relativament fons més fosc. A la part inferior, imatge d'algues verdes Zygnema mostrada a la dreta (etiqueta DL). El vector representat pel progrés de la longitud d'ona d'1/4, que es mostra com una ona envoltant giratòria en sentit contrari a les agulles del rellotge de 90-grau en contrast de fase positiu, apareix entre la figura i la imatge de la figura 1.
Alternativament, l'òptica del microscopi també es pot fabricar per produir una fase negativa oposada, tal com es mostra a la part inferior de la figura 1, en aquest cas les ones envoltants (S) es retarden (en lloc d'avançar) per un quart de longitud d'ona relativa a l'ona difractada (D). Com a resultat, els exemplars amb alts índexs de refracció semblen més brillants sobre un fons gris més fosc (vegeu la imatge inferior etiquetada BM a la figura 1). En fase negativa oposada, la placa de fase objectiu conté un anell elevat que retarda la fase (en lloc d'avançar la fase com a fase positiva oposada), passant un quart de longitud d'ona en relació a la fase de l'ona difractada com a ona envoltant d'ordre zero. Com que les ones difractades s'han retardat un quart de longitud d'ona a mesura que travessen l'espècimen, s'elimina la diferència de camí òptic entre les ones circumdants i difractades i la mostra d'índex de refracció alt interfereix constructivament en el pla de la imatge. Tingueu en compte que l'ona de partícula resultant (P) és més gran en amplitud que l'ona envoltant (S) en contrast de fase negatiu. També es mostra una fase negativa inversa, on el vector d'ona de circumnavegació passa per una rotació de 90 graus en el sentit de les agulles del rellotge del diagrama vectorial.
