Característiques tècniques i habilitats d'ús del microscopi de fluorescència de dos fotons
La microscòpia de fluorescència de dos fotons és una nova tecnologia que combina la microscòpia confocal d'escaneig làser i la tecnologia d'excitació de dos fotons.
El principi bàsic de l'excitació de dos fotons és: en el cas d'alta densitat de fotons, les molècules fluorescents poden absorbir dos fotons de longitud d'ona llarga al mateix temps i emetre un fotó de longitud d'ona més curta després d'un període curt de l'anomenat estat de vida excitat. . ; L'efecte és el mateix que utilitzar un fotó amb una longitud d'ona la meitat de la longitud d'ona llarga per excitar una molècula fluorescent. L'excitació de dos fotons requereix una alta densitat de fotons. Per no danyar les cèl·lules, la microscòpia de dos fotons utilitza làsers polsats bloquejats en mode d'alta energia. El làser emès per aquest làser té una energia màxima alta i una energia mitjana baixa, la seva amplada de pols és de només 100 femtosegons i el seu període pot arribar als 80 a 100 megahertz. Quan s'utilitza una lent d'objectiu d'obertura numèrica alta per enfocar els fotons del làser polsat, la densitat de fotons al punt focal de la lent objectiu és la més alta i l'excitació de dos fotons només es produeix al punt focal de la lent objectiu, de manera que el microscopi de dos fotons no necessita un forat confocal, cosa que millora l'eficiència de detecció de fluorescència. És un mètode d'investigació important en els camps de la morfologia, la biologia cel·lular molecular, la neurociència i la farmacologia.
1. Antecedents de l'aparició de la microscòpia de dos fotons: dues limitacions de la microscòpia confocal làser tradicional:
1) Un és el fenomen de la fototoxicitat: perquè el forat confocal ha de ser prou petit per obtenir una imatge d'alta resolució, i la petita obertura bloquejarà gran part de la fluorescència emesa per la mostra, inclosa la fluorescència emesa des del pla focal, el corresponent Sí, la llum d'excitació ha de ser prou forta per obtenir una relació senyal-soroll suficient; i el làser d'alta intensitat farà que el colorant fluorescent s'esvaeixi ràpidament durant l'exploració contínua, i el senyal fluorescent es farà cada cop més feble a mesura que avança l'escaneig.
2) La fototoxicitat és un altre problema. Sota la irradiació làser, moltes molècules de colorants fluorescents produiran citotoxines com ara oxigen singlet o radicals lliures, de manera que el temps d'exploració i la densitat de potència òptica de la llum d'excitació s'han de limitar a l'experiment per mantenir la densitat de la mostra. actiu. En la recerca sobre mostres actives, especialment les diferents etapes de creixement i desenvolupament de mostres actives, el fotoblanqueig i la fototoxicitat fan que aquests estudis siguin molt limitats.
2. Per què dius que els microscopis de dos fotons generalment no necessiten estar equipats amb làsers d'excitació ultraviolada?
La microscòpia de dos fotons és una tecnologia d'excitació de fluorescència basada en l'efecte d'excitació de dos fotons: les molècules de colorant fluorescent es poden excitar absorbint dos fotons de baixa energia al mateix temps (l'interval de temps entre dos fotons que arriben a les molècules fluorescents és inferior a 1 femtosegundo). ), el seu efecte d'excitació pot ser equivalent a absorbir un fotó d'alta energia de 1/2 longitud d'ona. Per exemple, absorbir dos fotons a longituds d'ona vermelles és equivalent a que una molècula absorbeixi l'ultraviolat. Els fotons de longitud d'ona llarga no són absorbits fàcilment per les cèl·lules, de manera que es redueix la fototoxicitat per a les cèl·lules vives i també es redueix el fotoblanqueig. D'aquesta manera, no només fa la funció d'excitació ultraviolada, sinó que també evita el dany de la llum ultraviolada a la mostra.
3. Què té d'especial el làser de microscopi de dos fotons?
La probabilitat d'absorció de dos fotons depèn de la proximitat que coincideixen els dos fotons incidents en l'espai i en el temps (els dos fotons han d'arribar en 10-18 segons). La secció transversal d'absorció de dos fotons és petita i només s'exciten els fluoròfors de les regions amb un gran flux de fotons. Per tant, la majoria dels làsers utilitzats són làsers de safir de titani, que poden assolir velocitats d'escaneig de picosegons o femtosegons, i tenen una potència màxima molt alta i una potència mitjana baixa, de manera que el fotoblanqueig i la fototoxicitat es poden reduir o eliminar. El més important és proporcionar una densitat molt alta de fotons en un rang reduït, que pugui garantir l'excitació simultània de dos fotons.
4. Quins són els avantatges de l'excitació de dos fotons?
1) Augmentar la selectivitat del colorant: el rang de llum d'excitació del làser del sistema confocal (Ar, Ar/Kr, HeNe) és de 488 nm - 647nm. Això significa experimentar amb tints fluorescents excitats per UV, per exemple, amb DAPI, Hoescht. La longitud d'ona d'excitació de dos fotons és el doble de la d'un sol fotó, de manera que els colorants excitats per l'ultraviolat poden ser excitats per la llum infraroja propera.
2) Reduir el fotoblanqueig: a causa de la reducció del fotoblanqueig, augmenta la taxa d'èxit dels experiments amb CFP/YFP per a la transferència d'energia de ressonància de fluorescència (FRET).
3) No es requereix cap objectiu especial: des del punt de vista del maquinari, l'excitació dels colorants excitats per UV amb la longitud d'ona de la llum infraroja propera no requereix components òptics UV especials.
4) Millorar la relació senyal-soroll: la longitud d'ona de la llum d'excitació i la longitud d'ona de la llum emesa tenen una gran diferència, cosa que millora la relació senyal-soroll.
5) Blanqueig localitzat al punt focal: com que l'excitació de la fluorescència només es produeix al punt focal de l'objectiu, no hi ha necessitat d'un forat confocal. Això millora la detecció de la llum i el fotoblanqueig només es produeix al punt focal.
6) Més fàcil de penetrar en mostres: la llum de longitud d'ona infraroja no es dispersa fàcilment per les cèl·lules i pot penetrar en mostres més profundes.
5. En comparació amb la microscòpia confocal d'escaneig làser, quina és la millora més gran que fa la microscòpia de dos fotons?
1) Reducció del fotoblanqueig.
2) Reducció de la fototoxicitat.
3) No és fàcil de dispersar, i és més fàcil penetrar mostres gruixudes, com ara rodanxes de cervell.
