Procediment estàndard per calibrar els polaritzadors en un microscopi polaritzador
El microscopi de fluorescència és diferent del microscopi òptic ordinari perquè no observa exemplars sota la il·luminació de fonts de llum ordinàries. En canvi, utilitza una certa longitud d'ona de llum (generalment llum ultraviolada, llum blava violeta) per excitar les substàncies fluorescents de l'espècimen sota el microscopi, fent-les emetre fluorescència. Per tant, el paper de la font de llum al microscopi de fluorescència no és la il·luminació directa, sinó com a font d'energia per excitar les substàncies fluorescents dins de la mostra. El motiu pel qual podem observar mostres no es deu a la il·luminació de la font de llum, sinó al fenomen de fluorescència que presenten les substàncies fluorescents a l'interior de la mostra després d'absorbir l'energia lluminosa excitada. A partir d'això, es pot veure que la característica de la microscòpia de fluorescència és principalment que la seva font de llum pot subministrar una gran quantitat de llum d'excitació en un rang de longitud d'ona específic, de manera que les substàncies fluorescents de la mostra poden obtenir la intensitat necessària de llum d'excitació. Al mateix temps, els microscopis de fluorescència han de tenir els sistemes de filtre corresponents. El microscopi de fluorescència és una eina fonamental en la química dels teixits de fluorescència. Està format per components principals, com ara una font de llum d'ultra-tensió, un sistema de filtre (incloses plaques de filtre d'excitació i supressió), un sistema òptic i un sistema de fotografia. Utilitza llum d'una certa longitud d'ona per excitar la mostra i emetre fluorescència.
1. Mètodes d'excitació de fluorescència: segons el rang de longitud d'ona de la llum, hi ha dos tipus: mètode d'excitació UV (utilitzant il·luminació ultraviolada) i mètode d'excitació BV (utilitzant llum blava violeta). El mètode d'excitació UV utilitza llum ultraviolada propera més curta que 400 nm per a l'excitació. Aquest mètode no té llum d'excitació visible, de manera que la fluorescència observada mostra la fluorescència inherent del colorant, cosa que facilita la distinció de la fluorescència específica de l'exemplar de l'autofluorescència del teixit de fons.
2. Mètode d'excitació BV: Implica l'excitació de la llum ultraviolada a la blava centrada a 404 nm i 434 nm. Aquest mètode utilitza llum blava per irradiar la mostra, de manera que el filtre de tall-del sistema d'observació de fluorescència ha d'utilitzar un filtre que pugui bloquejar completament la llum blava i passar completament a través de la fluorescència verda i groga necessària. Pigments fluorescents utilitzats per al mètode d'anticossos fluorescents. La longitud d'ona màxima d'absorció de la llum d'excitació i la longitud d'ona màxima d'emissió de fluorescència són relativament properes, de manera que el filtre utilitzat en el mètode d'excitació BV ha d'utilitzar un filtre de tall nítid. Aquest mètode pot utilitzar llum blava com a llum d'excitació, de manera que l'eficiència d'absorció dels pigments fluorescents és alta i es poden obtenir imatges més brillants. El desavantatge és que la fluorescència per sota de 500 nm no es pot veure, mentre que la fluorescència per sobre de 500 nm fa que tota la imatge sembli groga. En el mètode d'anticossos fluorescents, l'especificitat es determina principalment pel color exclusiu dels pigments fluorescents, de manera que quan es parla de l'especificitat subtil, els inconvenients del mètode d'excitació BV esmentat anteriorment sovint tenen un impacte significatiu.
