Tècniques de tinció i observació microscòpica de microorganismes
Tinció simple de bacteris
1 Objectius
1.1 Aprendre les tècniques bàsiques de frotis i tinció microbiana.
1.2 Dominar el mètode senzill de tinció de bacteris.
1.3 Conèixer les característiques morfològiques dels bacteris, i consolidar l'aprenentatge de l'ús del mirall d'oli i les tècniques d'operació asèptica.
2 Principi El frotis i la tinció de bacteris és una tècnica bàsica en experiments de microbiologia. Les cèl·lules dels bacteris són petites i transparents, no són fàcils de reconèixer amb el microscopi de llum normal i s'han de tacar. L'ús d'un sol colorant per tacar els bacteris, de manera que l'organisme tacat i el fons formin una diferència de color clara, de manera que la seva morfologia i estructura es puguin observar amb més claredat. Aquest mètode és fàcil de realitzar i és adequat per a l'observació de la forma general de l'organisme i la disposició dels bacteris. Els colorants alcalins s'utilitzen habitualment per a una tinció senzilla, perquè en solucions neutres, alcalines o dèbilment àcides, les cèl·lules bacterianes solen tenir càrrega negativa i, quan els colorants alcalins s'ionitzen, la part de tinció de les seves molècules està carregada positivament, de manera que la part de tinció dels colorants alcalins. es pot unir fàcilment als bacteris per fer-los acolorits. Les cèl·lules bacterianes tacades contrasten clarament amb el fons i són més fàcils de reconèixer al microscopi. Els colorants que s'utilitzen habitualment per a la tinció senzilla inclouen el blau de merocianina, el violeta cristal·lí i el vermell compost bàsic. Quan la descomposició bacteriana del sucre per produir àcid de manera que el pH del medi disminueix, la càrrega positiva dels bacteris augmenta, i després es pot utilitzar en vermell, vermell àcid o vermell Congo i altres colorants àcids. Els bacteris s'han de fixar abans de la tinció. La seva finalitat és doble: una és matar els bacteris i fer que els bacteris s'adhereixin al portaobjectes; el segon és augmentar la seva afinitat pel colorant. S'utilitzen habitualment dos mètodes: calefacció i fixació química. Intenta mantenir la morfologia original de les cèl·lules en fixar-les.
3 Materials
3.1 Cultiu inclinat d'agar nutrient de la soca Bacillus subtilis 12-18h, cultiu inclinat d'agar nutrient d'Staphylococcus aureus unes 24 hores, cultiu inclinat d'agar nutrient d'Escherichia coli 24 hores, cultiu d'agar inclinat de llevat de forner.
3.2 Taca Taca de blau de metilè alcalí de Lue (o taca de violeta cristall d'oxalat d'amoni), color vermell compost d'àcid carbòlic.
3.3 Instruments o altre parafernàlia Microscopi, làmpada d'alcohol, portaobjectes, anell d'inoculació, porta portaobjectes, ampolla de doble capa (plena d'oli de cedre i xilè), paper de microscopi, aigua fisiològica salina o destil·lada, etc.
4 Procediment Frotis → assecat → fixació → tinció → rentat → assecat → examen microscòpic.
5 passos
5.1 Frotis Preneu dues portaobjectes netes i sense oli, cadascuna amb una petita gota de solució salina (o aigua destil·lada) al centre del portaobjectes en condicions asèptiques, amb un anell d'inoculació per operar asèpticament, respectivament, a partir del Bacillus subtilis, Garcinia micrococcus. i Escherichia coli inclinat per recollir una mica de molsa a la gota d'aigua, barrejant-la i recoberta amb una pel·lícula. Si la suspensió bacteriana (o el cultiu líquid) s'estén, es pot utilitzar per inocular l'anell de recollida de 2 a 3 anells directament a la diapositiva. Tingueu en compte que la solució salina (aigua destil·lada) i prendre els bacteris no ha de ser massa i repartir-se uniformement, no massa espessa.
5.2 Assecat Assecar naturalment a temperatura ambient. També es pot assecar escalfant una mica per sobre d'una làmpada d'alcohol amb la cara recoberta cap amunt. Tanmateix, no us acosteu massa a la flama, perquè la temperatura és massa alta destruirà la morfologia dels bacteris.
5.3 Fixació Si s'utilitza l'assecat per calor, la fixació i l'assecat es combinen en un sol pas de la mateixa manera que l'assecat. Untar, assecar i fixar amb calor.
5.4 Tinció Col·loqueu la diapositiva plana a la prestatgeria de la diapositiva, afegiu 1 o 2 gotes de solució de tinció sobre el frotis (la solució de tinció només cobreix la pel·lícula de frotis és adequada). Tingueu el frotis amb el blau Mellanox bàsic de Lü durant 1 ~ 2 minuts i amb vermell carbonat (o violeta de cristall d'oxalat d'amoni) durant aproximadament 1 min.
5.5 Esbandida Aboqueu la solució de tinció i esbandiu suaument amb aigua de l'aixeta des d'un extrem del portaobjectes fins que l'aigua que baixa del frotis sigui incolora. Quan esbandiu, no deixeu que l'aigua flueixi directament per rentar la superfície recoberta. El flux d'aigua no ha de ser massa ràpid o massa gran per evitar que la pel·lícula de frotis es desprengui.
5.6 Assecat Sacsegeu les gotes d'aigua del portaobjectes perquè s'assequin de manera natural, es pot utilitzar paper absorbent o sec per absorbir-lo (compte amb no netejar el cos bacterià). 5.7 Examen microscòpic El frotis s'asseca i s'examina per microscòpia. El frotis ha d'estar completament sec abans que es pugui observar amb un microscopi d'oli.
6 Resultats Dibuixa la morfologia d'E. coli i Micrococcus garciniae després d'una tinció única.
Taca de Gram
1 Propòsit
1.1 Entendre el principi de la tinció de Gram i la seva importància en la classificació i identificació de bacteris.
1.2 Aprendre i dominar la tècnica de la tinció de Gram i consolidar l'aprenentatge de l'ús de la lent d'oli del microscopi de llum.
