Requisits de preparació de mostres per a la microscòpia de fluorescència
Requisits per a la preparació de la mostra per a la microscòpia de fluorescència
(1) Porta de vidre
El gruix del vidre lliscant ha d'estar entre 0.8-L2 mm. Una diapositiva massa gruixuda absorbirà més llum d'una banda i, d'altra banda, no pot centrar la llum d'excitació a la mostra. Les diapositives han de ser llises, de gruix uniforme i lliures d'autofluorescència evident. De vegades s'utilitzen diapositives de quars.
(2) Vidre cobert
El gruix de la coberta de vidre és d'aproximadament 0,17 mm, llisa. Per reforçar la llum d'excitació, també es pot utilitzar un vidre de coberta d'interferència, que és un vidre de coberta especial recobert amb diverses capes de substàncies (com ara fluorur de magnesi) que tenen diferents efectes d'interferència sobre la llum de diferents longituds d'ona, que poden fer que el fluorescència suau. La llum d'excitació es fa passar i la llum d'excitació es reflecteix, i aquesta llum d'excitació reflectida pot excitar l'exemplar.
(3) Exemplar
Les rodanxes de teixit o altres exemplars no han de ser massa gruixudes. Si el gruix és massa gruixut, la major part de la llum d'excitació es consumirà a la part inferior de la mostra, mentre que la part superior observada directament per la lent de l'objectiu no es pot excitar completament. A més, la fluorescència causada per cèl·lules o impureses superposades, la tinció inespecífica de fons afecta el judici.
(4) oli de mirall
En general, quan s'observen mostres amb microscopis de fluorescència de camp fosc i microscopis d'immersió en oli, s'ha d'utilitzar oli d'immersió. El millor és utilitzar oli especial d'immersió no fluorescent. També es pot utilitzar glicerina, i també es pot utilitzar parafina líquida, però l'índex de refracció és baix, la qual cosa té un lleuger impacte en la qualitat de la imatge.
Comprendre el cub de llum de la microscòpia de fluorescència
La fluorescència és la llum que els electrons d'una substància absorbeixen energia lluminosa d'un estat de baixa energia a un estat d'alta energia i després alliberen llum quan torna a un estat de baixa energia. És una llum irradiada sense temperatura: luminescència. És a dir: la substància absorbeix llum d'ona curta, entra en estat excitat i emet llum d'ona llarga.
Tant si es tracta de l'autofluorescència de la substància, del colorant fluorescent o de la proteïna fluorescent expressada per fusió, s'ha d'excitar per una longitud d'ona específica de la llum (excitació). Després que els electrons migren i perden energia, emeten llum d'una determinada longitud d'ona llarga (emissió). , que pot ser recollit pel sistema de detecció per aconseguir la funció d'identificar fluorescència específica.
Què és un cub de llum fluorescent?
En l'observació i la imatge del microscopi de fluorescència, la llum d'excitació de la longitud d'ona específica i la llum d'emissió de longitud d'ona llarga corresponent són proporcionades pel cub de llum de fluorescència, de manera que el senyal de fluorescència es pot recollir a simple vista, pantalla o càmera. Per tant, el cub de llum de fluorescència determina què es pot detectar. El dispositiu clau del senyal de fluorescència, les seves característiques inclouen EX: paràmetres de filtre de longitud d'ona d'excitació, EM: paràmetres de filtre de longitud d'ona d'emissió i DM: paràmetres de mirall dicotòmics. Preneu com a exemple el cub de llum DAPI del microscopi de fluorescència integrat Revolve, EX: 385/30, EM: 450/50, DM: 425.
The light emitted by the light source passes through DAPI EX to obtain excitation light in a specific wavelength range, that is, light of 385±15nm, which specifically excites fluorescent substances that can only be excited within this range; the DM dichroic mirror separates the excitation light from the fluorescence Optical elements, as special mirrors, reflect only specific wavelengths of light and allow all other wavelengths to pass through, so only >La llum de 425 nm es pot transmetre a l'EM; Els filtres d'emissió EM s'utilitzen per separar la fluorescència emesa pel fluoròfor d'altres elements òptics de fons per separar la llum. Els filtres d'emissió transmeten llum a la longitud d'ona de fluorescència a través del mirall dicroic mentre bloquegen tota la resta de llum que es filtra de la font de llum d'excitació (reflectada per la mostra o l'òptica). La longitud d'ona de la llum emesa és més gran que l'EM per observar, és a dir, només entra llum dins del rang de 450 ± 25 nm al sistema de detecció. La selecció adequada de les dicotomies EX, EM i DM pot ajudar els investigadors a aconseguir relacions senyal-soroll (S/N) més altes.
