Principis de la microscòpia de fluorescència
Els microscopis de fluorescència són diferents dels microscopis òptics ordinaris. En lloc d'observar mostres sota la il·luminació de fonts de llum ordinàries, utilitzen llum d'una certa longitud d'ona (generalment llum ultraviolada, llum blava-violada) per excitar les substàncies fluorescents de les mostres sota el microscopi per fer-les emetre fluorescència. Per tant, la font de llum d'un microscopi de fluorescència no funciona com a il·luminació directa, sinó com una font d'energia que excita les substàncies fluorescents de l'espècimen. El motiu pel qual podem observar l'exemplar es deu a la il·luminació de la font de llum, però el fenomen de fluorescència que es presenta després que la substància fluorescent de l'exemplar absorbeixi l'energia lluminosa excitada.
Es pot veure que la característica del microscopi de fluorescència és que la seva font de llum pot subministrar una gran quantitat de llum d'excitació en un rang de longitud d'ona específic, de manera que la substància fluorescent de la mostra provada pot obtenir la llum d'excitació de la intensitat necessària. Al mateix temps, el microscopi de fluorescència ha de tenir el sistema de filtre corresponent.
La microscòpia de fluorescència és una eina essencial en la histoquímica d'immunofluorescència. Es compon de font de llum d'ultra alt voltatge, sistema de filtre (inclosa placa de filtre d'excitació i supressió), sistema òptic i sistema de fotografia i altres components principals. Utilitza llum d'una certa longitud d'ona per excitar l'espècimen perquè emeti fluorescència.
La manera d'excitar la fluorescència: segons el rang de longitud d'ona de la llum, es pot dividir en dos tipus: mètode d'excitació UV (utilitzant el mètode d'il·luminació ultraviolada) i mètode d'excitació BV (utilitzant llum blava-violada). El mètode d'excitació UV utilitza llum gairebé ultraviolada de menys de 400 nm per a l'excitació. No hi ha llum d'excitació visible en aquest mètode, de manera que la fluorescència observada presenta la fluorescència inherent del colorant, i és fàcil distingir la fluorescència específica de la mostra de l'autofluorescència del teixit de fons.
El mètode d'excitació BV es basa en 404 nm i 434 nm per a l'excitació de la llum ultraviolada a la blava. Aquest mètode utilitza llum blava per irradiar la mostra, de manera que el filtre de tall del sistema d'observació de fluorescència ha d'utilitzar un filtre que pugui bloquejar completament la llum blava i passar completament la fluorescència verda i groga necessària. Colorants fluorescents per a assajos d'anticossos fluorescents. La longitud d'ona d'absorció màxima de la llum d'excitació és relativament propera a la longitud d'ona màxima d'emissió de fluorescència, de manera que el filtre utilitzat en el mètode d'excitació BV ha d'utilitzar un filtre de tall nítid. Aquest mètode pot utilitzar llum blava com a llum d'excitació, de manera que l'eficiència d'absorció del pigment fluorescent és més alta i es pot obtenir una imatge més brillant. El seu desavantatge és que la fluorescència per sota de 500 nm no es pot veure, i la fluorescència per sobre de 500 nm fa que tota la imatge sembli groga. En el mètode d'anticossos fluorescents, l'especificitat del fluorocrom sovint es jutja pel color exclusiu del fluorocrom. Per tant, quan es parla de l'especificitat subtil, les deficiències esmentades anteriorment del mètode d'excitació BV sovint tenen una gran influència.
En resum, la il·luminació del microscopi de fluorescència es pot considerar segons els tres punts següents segons l'estructura del condensador i la longitud d'ona de la llum d'excitació.
① Des de la perspectiva dels requisits de contrast de la imatge fluorescent, s'utilitza el concentrador de camp fosc d'excitació UV per a la il·luminació.
② Tenint en compte la brillantor de la imatge, el filtre d'excitació BV té la més alta eficiència d'observació de camp fosc.
③Les característiques de l'observació del camp fosc del filtre d'excitació UV i la il·luminació del concentrador del camp fosc d'excitació BV es poden considerar entre aquests dos mètodes d'il·luminació, però el primer té propietats de camp fosc més fortes i mostra imatges més brillants. El contrast és petit; aquest últim conserva les propietats del camí de la llum del camp fosc, de manera que la imatge mostrada és més fosca i es millora el contrast. Quan s'utilitza realment un microscopi de fluorescència, s'ha d'utilitzar per a l'observació el mètode d'il·luminació que s'adapti millor als requisits de la mostra.
Cal assenyalar que fins i tot si el condensador de camp fosc excitat per UV amb el millor contrast està il·luminat, una part de la llum d'excitació ultraviolada refractada o dispersa per l'exemplar entrarà a la lent de l'objectiu. L'autofluorescència pot empitjorar la resposta de la imatge. Per tant, s'ha d'utilitzar un filtre que absorbeix UV davant de l'ocular com a filtre de tall.
