Principis de la microscòpia confocal
El microscopi confocal és un instrument d'imatge d'alta precisió que va sorgir i es va desenvolupar a la dècada de 1980, i és un instrument de recerca científica essencial per estudiar estructures submicròniques. Amb el desenvolupament d'ordinadors, programari de processament d'imatges i làsers, els microscopis confocals també han experimentat un gran desenvolupament, i ara s'utilitzen àmpliament en els camps de la biologia, els microsistemes i la mesura de materials. El microscopi confocal és un nou tipus de microscopi que integra el principi confocal, la tecnologia d'escaneig i la tecnologia de processament de gràfics per ordinador. Els seus principals avantatges són: alta resolució lateral i alta resolució axial, i supressió efectiva de la llum dispersa, amb alt contrast.
Una configuració típica del microscopi confocal és col·locar dos petits forats al pla conjugat del pla focal de l'objecte mesurat, un dels quals es col·loca davant de la font de llum i l'altre davant del detector, tal com es mostra a la figura. 1. A la figura es pot veure que quan la mostra mesurada es troba en el pla quasi-focus, la intensitat lumínica recollida per l'extrem de detecció és la més gran; quan la mostra mesurada es troba en la posició desenfocada, el punt de llum a l'extrem de detecció es difon i la intensitat de la llum disminueix ràpidament. Per tant, només la llum emesa pels punts del pla focal pot passar pel forat de sortida, mentre que la llum emesa pels punts fora del pla focal es desenfoca al pla del forat de sortida i la majoria d'ells no poden passar pel forat central. Per tant, el punt objectiu d'observació del pla focal sembla brillant i el punt de no observació apareix negre com a fons, augmentant el contrast i netejant la imatge. Durant el procés d'imatge, els dos forats són confocals, el punt confocal és el punt detectat i el pla on es troba el punt detectat és el pla confocal.
La mida del forat al detector en microscòpia confocal té un paper crític. Afecta directament la resolució i la relació senyal-soroll del sistema. Si el forat és massa gran, no s'aconseguirà l'efecte de detecció confocal, que no només redueix la resolució del sistema, sinó que també introdueix més llum dispersa; si el forat és massa petit, reduirà l'eficiència de detecció i reduirà la imatge microscòpica. brillantor. Els estudis han demostrat que quan el diàmetre del forat és igual al diàmetre del disc Airy, es compleixen els requisits confocals i l'eficiència de detecció no es redueix significativament. Com que el diàmetre del forat és generalment de l'ordre de micres, si hi ha una desviació entre el punt d'enfocament del feix làser i la posició del forat, es produirà una distorsió del senyal. Per tant, els microscopis confocals utilitzen generalment un sistema d'enfocament automàtic, que pràcticament augmenta el temps de mesura.
Com que el microscopi d'exploració confocal làser és una imatge puntual, per obtenir una imatge bidimensional de l'objecte, és necessari utilitzar l'exploració bidimensional en les direccions x i y. Els diferents microscopis utilitzen diferents mètodes d'escaneig:
(1) Escaneig d'objectes. És a dir, el propi objecte es mou segons una determinada llei, mentre que el feix de llum es manté inalterable. Avantatges: camí òptic estable; Desavantatges: es requereix una taula d'escaneig gran, de manera que la velocitat d'escaneig és molt limitada.
(2) Es forma un sistema d'escaneig de feix utilitzant un galvanòmetre reflectant. És a dir, controlant el galvanòmetre d'escaneig, el punt de llum enfocat es reflecteix regularment a una determinada capa de l'objecte per completar l'escaneig bidimensional. El seu avantatge és que té una alta precisió i sovint s'utilitza per a mesuraments d'alta precisió. La velocitat d'escaneig ha millorat respecte a l'escaneig d'objectes, però encara no és ràpida.
(3) Utilitzeu l'element de deflexió acústica-òptica per a l'escaneig, i l'escaneig es realitza canviant la freqüència de sortida de l'ona sonora i després canviant la direcció de transmissió de l'ona de llum. El seu avantatge destacat és que la velocitat d'escaneig és molt ràpida. El sistema d'escaneig desenvolupat pels Estats Units utilitza un deflector acústic-òptic per generar imatges de vídeo en temps real. Només es necessita 1/30 s per escanejar una imatge bidimensional i gairebé aconsegueix una sortida en temps real.
(4) Escaneig de disc Nipkow. El procés d'escaneig es completa fent girar el disc Nipkow mentre es mantenen quiets els altres components. Es pot fer imatges alhora i la velocitat és molt ràpida. Tanmateix, com que el feix d'imatge és llum fora de l'eix, s'ha de corregir l'aberració fora de l'eix de la lent i la taxa d'utilització de l'energia lumínica és molt baixa.
