Principi i aplicació de la microscòpia de fluorescència
(1) El principi i les característiques estructurals del microscopi de fluorescència: el microscopi de fluorescència utilitza una font de llum puntual amb una alta eficiència lluminosa per emetre llum d'una determinada longitud d'ona (com ara llum ultraviolada de 3650 polzades o llum blava porpra de 4200 polzades) a través del sistema de filtres. com a llum d'excitació per excitar l'exemplar. Després que la substància fluorescent a l'interior emeti fluorescència de diversos colors, s'observa mitjançant l'ampliació de la lent de l'objectiu i l'ocular. D'aquesta manera, sota un fons de fort contrast, encara que la fluorescència sigui molt feble, és fàcil d'identificar i té una alta sensibilitat. S'utilitza principalment per a la investigació de l'estructura i la funció cel·lular i la composició química. L'estructura bàsica d'un microscopi de fluorescència es compon d'un microscopi òptic ordinari més alguns accessoris (com ara una font de llum fluorescent, un filtre d'excitació, un divisor de feix de dos colors i un filtre de bloqueig, etc.). Font de llum fluorescent: generalment s'utilitza làmpada de mercuri d'ultra alta pressió (50-200W), que pot emetre llum de diverses longituds d'ona, però cada substància fluorescent té una longitud d'ona d'excitació que produeix la fluorescència més forta, per la qual cosa cal afegir una filtre d'excitació (generalment, hi ha filtres d'excitació ultraviolats, morats, blaus i verds), que només permeten que la llum d'excitació d'una certa longitud d'ona passi i irradii l'exemplar, alhora que absorbeix una altra llum. Després que cada substància sigui irradiada per llum d'excitació, emet fluorescència visible amb una longitud d'ona més gran que la longitud d'ona d'irradiació en molt poc temps. La fluorescència és específica i generalment més feble que la llum d'excitació. Per observar una fluorescència específica, es requereix un filtre de bloqueig (o supressió) darrere de la lent de l'objectiu. Té dues funcions: una és absorbir i bloquejar l'entrada de llum d'excitació a l'ocular, per no pertorbar la fluorescència i danyar els ulls; l'altre és seleccionar i deixar passar la fluorescència específica, mostrant un color fluorescent específic. Els dos filtres s'han d'utilitzar junts.
Hi ha dos tipus de microscopis de fluorescència pel que fa als seus camins òptics:
1. Microscopi de fluorescència de transmissió: la font de llum d'excitació excita la fluorescència a través del material de la mostra a través de la lent del condensador. S'utilitza habitualment un col·lector de camp fosc i també es pot utilitzar un col·lector ordinari per ajustar el mirall de manera que la llum d'excitació es transmeti i es passi a l'espècimen. Aquest és un microscopi de fluorescència antic. L'avantatge és que la fluorescència és forta amb un augment baix, i l'inconvenient és que la fluorescència disminueix amb l'augment de la magnificació. Per tant, és millor observar materials d'exemplars més grans.
2. Microscopi epifluorescència Aquest és un nou tipus de microscopi de fluorescència desenvolupat en els temps moderns. La diferència és que la llum d'excitació cau de la lent de l'objectiu a la superfície de la mostra, és a dir, s'utilitza la mateixa lent objectiu com a condensador d'il·luminació i la lent objectiu per recollir fluorescència. Cal afegir un divisor de feix dicroic al camí de la llum, que es troba a 45 graus de distància de l'urani lleuger. La llum d'excitació es reflecteix a la lent de l'objectiu i es recull a la mostra. La fluorescència generada per la mostra i la llum d'excitació reflectida per la superfície de la lent de la lent de l'objectiu i la superfície del vidre de la coberta entren a la lent de l'objectiu alhora i tornen al divisor de feix de dos colors per separar la llum d'excitació de la fluorescència. , la llum d'excitació residual s'absorbeix mitjançant filtres de bloqueig. Si canvieu a una combinació de diferents filtres d'excitació/divisors de feix de dos colors/filtres de bloqueig, es poden satisfer les necessitats de diferents productes de reacció fluorescent. L'avantatge d'aquest tipus de microscopi de fluorescència és que la il·luminació del camp de visió és uniforme, la imatge és clara i com més gran sigui l'augment, més forta serà la fluorescència.
(2) Com utilitzar el microscopi de fluorescència.
1. Enceneu la font de llum, la làmpada de mercuri d'ultra-alta pressió s'ha d'escalfar durant uns minuts per arribar al punt més brillant.
2. Per al microscopi de fluorescència de transmissió, s'ha d'instal·lar el filtre d'excitació necessari entre la font de llum i el condensador, i el filtre de bloqueig corresponent s'ha d'instal·lar darrere de la lent de l'objectiu. Els microscopis d'epifluorescència han d'inserir el filtre d'excitació necessari/separador de feix de color dual/insercions de filtre de bloqueig a les ranures del camí de la llum.
3. Observeu amb una lent de baix augment, i ajusteu el centre de la font de llum segons el dispositiu d'ajust dels diferents tipus de microscopis de fluorescència de manera que estigui situat al centre de tot el punt d'il·luminació.
4. Col·loqueu la làmina de mostra i observeu després d'enfocar. S'ha de parar atenció durant l'ús: no observar directament amb el filtre final, per no causar danys als ulls; quan s'observa la mostra amb una lent d'oli, s'ha d'utilitzar una lent d'oli especial sense fluorescència; després d'apagar la làmpada de mercuri d'alta pressió, no es pot tornar a encendre immediatament i s'ha de provar. Es pot reiniciar després de 5 minuts, en cas contrari serà inestable i afectarà la vida útil de la làmpada de mercuri.
(3) Observació Mitjançant un filtre de llum blau-violeta sota un microscopi fluorescent a la plataforma d'ensenyament, es pot veure que les cèl·lules tacades amb un colorant fluorescent taronja d'acridina del 0,01 per cent, el nucli i el citoplasma s'emocionen per produir dos colors diferents de fluorescència (fosc) verd i taronja-vermell).
