Aula d'Imatge Microscòpica丨Aplicació de la Microscòpia de Fluorescència
La microscòpia de fluorescència de reflexió interna total (TIRFM) és una tècnica que utilitza l'ona evanescent generada per un feix de llum que es propaga entre dos medis d'índex de refracció diferents per sondejar la superfície de cèl·lules vives marcades amb fluorescència. A la pràctica, quan un raig làser incident troba la interfície entre el cobreobjectes i el medi aquós que conté les cèl·lules, es reflecteix a l'angle crític (reflexió interna total). Com que l'energia de l'ona evanescent disminueix exponencialment amb la distància del cobertor, només els fluoròfors dins de 10 nanòmetres de la superfície (entre 10 i 200 nanòmetres) són excitats per l'ona evanescent, mentre que els fluoròfors més allunyats no estan en gran part excitats. Afectat. Així, TIRFM dóna com a resultat nivells de senyal alts dels fluoròfors situats a prop del cobertor, superposats a un fons molt fosc, proporcionant una excel·lent relació senyal-soroll. L'extrema limitació de la profunditat d'excitació és ideal per estudiar molècules individuals o composició de membrana i orgànuls en cèl·lules adherides a prop de la superfície del cobertor (vegeu la figura 8 (e)). Atès que l'excitació es limita a les regions primes properes al cobertor, el fotoblanqueig i la fototoxicitat també es restringeixen a aquestes regions, fent de TIRFM un dels mètodes més útils per a l'observació a llarg termini. La tècnica s'ha convertit en una eina fonamental per estudiar una àmplia gamma de fenòmens en biologia cel·lular i molecular.
La deconvolució és un algorisme aplicat a un conjunt d'imatges de tot focus adquirides al llarg de l'eix òptic (Z) per millorar el senyal de fotons en una pila d'imatges per a un pla d'imatge determinat o múltiples plans focals. Els microscopis han d'estar equipats amb unitats d'enfocament motoritzats d'alta precisió per garantir l'adquisició d'imatges a intervals definits amb precisió entre els plans focals de la mostra. En una aplicació típica (vegeu la figura 8(f)), el procés de desconvolució s'utilitza per desenfocar i eliminar la llum desenfocada d'un pla focal determinat mitjançant l'excitació i l'emissió de fluorescència de camp ampli. L'aplicació més complexa és aplicar el procés de deconvolució a tota la pila d'imatges per generar vistes projectades o models 3D. Un conjunt d'imatges de camp ampli utilitzades per a la deconvolució captura el nombre màxim teòric de fotons emesos per la mostra. El procés de deconvolució redistribueix les intensitats "borroses" dels fotons emesos per sobre i per sota del pla focal de tornada al pla original. Així, la deconvolució utilitza gairebé totes les intensitats d'emissió disponibles i proporciona un pressupost de llum òptim, fent d'aquesta tècnica el mètode escollit per a mostres molt sensibles a la llum.
Una variant del fenomen de transferència d'energia de ressonància en microscòpia de fluorescència, fluorescència o transferència d'energia de ressonància de Förster (FRET) s'utilitza per obtenir informació temporal i espacial quantitativa sobre la unió i la interacció de proteïnes, lípids, enzims i àcids nucleics a les cèl·lules vives. FRET pot utilitzar tècniques d'estat constant o resoltes en el temps, però les imatges FRET resoltes en el temps tenen l'avantatge de mapejar amb més precisió les distàncies donant-acceptador. Es pot utilitzar un microscopi de fluorescència de camp ampli estàndard equipat amb filtres d'excitació i emissió adequats i una càmera sensible per a la imatge FRET. Actualment, s'utilitzen àmpliament en biologia cel·lular els biosensors que intercalen una proteïna o pèptid ambientalment sensible entre dues proteïnes fluorescents aplicables a FRET. Aquestes sondes s'imatgen fàcilment amb microscòpia de fluorescència de camp ampli mitjançant tècniques FRET d'emissió sensibilitzada combinades amb anàlisis ratiomètriques. A més, la imatge espectral i la desmescla lineal mitjançant microscòpia confocal d'escaneig làser poden ajudar a controlar els fenòmens FRET en biosensors i altres aplicacions de proteïnes fluorescents.
La microscòpia d'imatge de fluorescència (FLIM) és una tècnica sofisticada capaç d'enregistrar simultàniament la vida útil de la fluorescència i la ubicació espacial d'un fluoròfor a cada lloc de la imatge. Aquest mètode proporciona un mecanisme per estudiar paràmetres ambientals com el pH, la concentració iònica, la polaritat del dissolvent, les interaccions no covalents, la viscositat i la tensió d'oxigen en cèl·lules vives individuals i presenta les dades en matrius espacials i temporals. Les mesures FLIM de les vides de l'estat excitat a l'escala de nanosegons són independents de les concentracions locals de fluoròfors, els efectes de fotoblanqueig i la longitud del camí (gruix de la mostra), però són sensibles a reaccions d'estat excitat com la transferència d'energia de ressonància. De fet, combinar FLIM amb FRET mitjançant el seguiment dels canvis de vida útil dels donants fluorescents abans i després de la transferència d'energia de ressonància es considera una de les millors maneres d'estudiar aquest fenomen.
La mobilitat (coeficient de difusió transversal) de macromolècules marcades amb fluorescència i petits fluoròfors es pot determinar mitjançant la recuperació de la fluorescència després de la tècnica de fotoblanqueig (FRAP). A FRAP, una àrea seleccionada molt petita (uns pocs micròmetres de diàmetre) s'il·lumina intensament, normalment amb un làser, per produir un fotoblanqueig complet del fluoròfor en aquesta zona. El resultat és una reducció o aniquilació espectacular de la fluorescència. Després d'un pols de fotoblanqueig, es va controlar la velocitat i l'extensió de la recuperació de la intensitat de la fluorescència a les regions blanquejades en funció del temps a intensitats d'excitació baixes per generar informació sobre la cinètica de la repoblació i recuperació de fluoròfors (figura 9). FRAP es realitza normalment mitjançant EGFP o altres proteïnes fluorescents. Les tècniques de fotoactivació relacionades es basen en fluoròfors sintètics especials en gàbia o proteïnes fluorescents de funcionalitat similar que es poden activar mitjançant polsos curts d'UV o violeta. La fotoactivació i el FRAP es poden utilitzar com a tècniques complementàries per determinar els paràmetres de mobilitat.
En una tècnica relacionada amb FRAP, anomenada pèrdua de fluorescència després del fotoblanqueig (FLIP), una regió fluorescent definida dins d'una cèl·lula viva se sotmet a un fotoblanqueig repetit per irradiació intensa. Si tots els fluoròfors poguessin difondre's a l'àrea que s'està fotoblanquejant durant el període de temps mesurat, això donaria lloc a una pèrdua completa de senyal fluorescent a tota la cèl·lula. Calculant la velocitat a la qual desapareix la fluorescència de tota la cèl·lula, es pot determinar la mobilitat de difusió del fluoròfor objectiu. A més, FLIP pot identificar fàcilment la ubicació i la naturalesa de qualsevol barrera de difusió entre compartiments individuals de les cèl·lules, com ara la barrera entre el soma i l'axó d'una neurona.
L'espectroscòpia de correlació de fluorescència (FCS), que s'utilitza principalment en la microscòpia confocal d'escaneig làser o en la microscòpia multifotònica, és un mètode dissenyat per determinar informació cinètica com ara velocitats de reacció química, coeficients de difusió, tècniques de pes molecular, cabal i agregació. A FCS, un petit volum (aproximadament un femtòmetre; el focus limitat per la difracció del làser) s'il·lumina amb un feix làser enfocat per registrar les fluctuacions d'intensitat d'autofluorescència induïdes per la dinàmica de les molècules fluorescents en funció del temps en el volum ocupat per fluorescents. molècules (Fig. 10). Els fluoròfors relativament petits es difonen ràpidament en el volum il·luminat, produint esclats curts d'intensitat aleatòria. Per contra, els complexos més grans (fluoròfors units a macromolècules) es mouen més lentament, produint patrons d'intensitat de fluorescència més llargs i persistents que depenen del temps.
Quan les estructures marcades amb fluorescència estan densament empaquetades i es superposen en regions específiques de cèl·lules vives, la seva dinàmica i distribució espacial són difícils d'analitzar. La microscòpia de punt de fluorescència (FSM) és una tècnica compatible amb gairebé totes les modalitats d'imatge que aprofita concentracions molt baixes de subunitats marcades amb fluorescència, redueix la fluorescència desenfocada i millora la visibilitat de les estructures marcades i la seva dinàmica en regions gruixudes. Els FSM s'implementen etiquetant només una fracció de tota l'estructura d'interès. En aquest sentit, FSM és similar a realitzar FCS en tot el camp de visió, encara que posa més èmfasi en els patrons espacials que en l'anàlisi temporal quantitativa. La microscòpia de punt fluorescent és especialment útil per determinar la mobilitat i l'agregació d'elements citoesquelètics com l'actina i els microtúbuls en cèl·lules hiperactives.
La microscòpia d'esgotament d'emissió estimulada (STED) és una tècnica emergent de superresolució amb una resolució espacial molt més enllà del límit de difracció, que utilitza llum esgotada en forma d'anell per envoltar un feix de llum d'excitació més petit per obtenir un eix inferior a -50 nm la resolució. La tècnica es basa en l'excitació de fluoròfors amb polsos làser sincronitzats i polsos STED circulars coordinats espacialment que esgoten la llum emesa, suprimint la fluorescència de les molècules excitades al voltant del focus d'escaneig làser. La fluorescència generada a la perifèria de la taca es suprimeix, però no al centre de la taca, la qual cosa redueix significativament la mida de la taca fluorescent i, per tant, augmenta significativament la resolució. STED ha demostrat ser una eina útil per a la detecció d'alta resolució de cèl·lules vives. Altres tècniques emergents de superresolució, com la microscòpia de localització fotoactivada (PALM) i la microscòpia d'il·luminació de llum estructurada (SIM), també es convertiran en eines fonamentals per a la imatge de cèl·lules vives en un futur proper.
L'ús creixent de proteïnes fluorescents codificades genèticament i fluoròfors sintètics avançats per a la imatge de cèl·lules vives obre la porta a noves modalitats òptiques per controlar la dinàmica temporal i les relacions espacials. Els microscopistes disposen ara d'un conjunt complet d'eines per observar i registrar dades d'imatge dels processos cel·lulars que es produeixen en una àmplia gamma d'escales de temps i amb múltiples resolucions. Els esdeveniments més lents es poden observar i registrar fàcilment mitjançant la microscòpia confocal d'escaneig làser, mentre que es poden obtenir esdeveniments cinètics més ràpids mitjançant la tecnologia de disc giratori. A més, la microscòpia multifotònica permet obtenir imatges profundes en teixits gruixuts, i les tècniques de reflexió interna total permeten sondejar les superfícies de la membrana amb precisió confocal. Els mètodes avançats de fluorescència, com ara FRET, FLIM, FRAP, FCS, FSM, SIM, PALM i STED, es poden utilitzar per controlar les interaccions proteïna-proteïna amb resolucions sovint millors que les permeses pel límit de difracció. Amb els avenços en la tecnologia de fluoròfors, microscopis i detectors, un món més ampli es portarà "sota el microscopi".
