Disseny de microscopi de fluorescència i camp brillant de baix cost
La microscòpia de fluorescència és un mètode utilitzat per visualitzar
En aquesta guia, revisaré els conceptes bàsics de la microscòpia de fluorescència i com construir tres microscopis de fluorescència diferents de baix cost. Aquests sistemes solen costar milers de dòlars, però hi ha hagut alguns esforços recents per fer-los més accessibles. Els dissenys que presento aquí utilitzen un telèfon intel·ligent, una reflex digital i un microscopi USB. Tots aquests dissenys també es poden utilitzar com a microscopis de camp clar.
Pas 1: Visió general de la microscòpia de fluorescència
Per comprendre els conceptes bàsics de la microscòpia de fluorescència, imagineu un bosc dens a la nit, amb arbres, animals, arbustos i altres boscos vius. Si enceneu una torxa al bosc, veureu totes aquestes estructures i us costarà visualitzar animals o plantes concrets. Suposem que només us interessa veure arbustos de nabius al bosc. Per fer-ho, entrenes la cuca perquè només se senti atreta pels arbustos de nabius, de manera que quan mires el bosc només s'il·luminin els arbustos de nabius. Es podria dir que utilitzeu cuques de llum per marcar arbustos de nabius de manera que pugueu veure estructures de nabius al bosc.
En aquesta analogia, el bosc representa la mostra sencera, els arbustos de nabius representen les estructures que voleu visualitzar (p. ex. cèl·lules específiques o orgànuls subcel·lulars) i les cuques de llum són compostos fluorescents. Il·luminar la torxa sola sense les lluernes és similar a la microscòpia de camp brillant.
El següent pas és comprendre la funció bàsica dels compostos fluorescents (també coneguts com fluoròfors). Els fluoròfors són en realitat petits objectes (nanoescala) dissenyats per connectar estructures específiques en una mostra. Absorbeixen un rang estret de longituds d'ona de llum i reemeten una altra longitud d'ona de llum. Per exemple, un fluoròfor pot absorbir llum blava (és a dir, el fluoròfor és excitat per la llum blava) i després tornar a emetre llum verda. Això normalment es resumeix amb els espectres d'excitació i emissió (a dalt). Aquests diagrames mostren la longitud d'ona de la llum absorbida pel fluoròfor i la longitud d'ona de la llum emesa pel fluoròfor.
El disseny del microscopi és molt similar al d'un microscopi de camp clar normal, amb dues diferències principals. En primer lloc, la llum que il·lumina la mostra ha d'estar a la longitud d'ona que excita el fluoròfor (per a l'exemple anterior, la llum és blava). En segon lloc, el microscopi només necessita recollir la llum emesa (llum verda) mentre bloqueja la llum blava. Això es deu al fet que la llum blava està a tot arreu, però la llum verda només prové d'estructures específiques de la mostra. Per bloquejar la llum blava, els microscopis solen tenir una cosa anomenada filtre de pas llarg que deixa passar la llum verda sense llum blava. Cada filtre de pas llarg té una longitud d'ona de tall. Si la llum té una longitud d'ona més gran que la longitud d'ona de tall, pot passar a través del filtre. D'aquí el nom, "pass llarg". Les longituds d'ona més curtes estan bloquejades.
Pas 2: Modelatge del microscopi amb òptica òptica
Aquest és un pas addicional als principis bàsics del disseny del microscopi. No cal construir un microscopi de fluorescència, de manera que podeu saltar-lo si no voleu aprofundir en l'òptica.
Tant els microscopis de camp clar com els de fluorescència es poden modelar mitjançant òptica de raigs. La premissa bàsica de l'òptica de raigs és que la llum es comporta de manera similar a la que s'allunya d'una font de llum. Quan mires al voltant d'una habitació, veus la llum del sol fora d'una finestra o d'una bombeta. Aleshores, la llum és absorbida o reflectida pels objectes de l'habitació. Part de la llum reflectida fa que es dirigeixi cap als ulls. Si l'objecte està il·luminat, podeu imaginar-vos que cada punt de l'objecte emet llum en totes direccions (a dalt). La lent, com la lent dels nostres ulls, enfoca la llum a un punt perquè puguem veure l'objecte. Sense una lent, la llum continua viatjant cap a l'exterior i no forma una imatge.
Llavors, com fem sistemes òptics que amplifiquin objectes petits? Per entendre el disseny, només necessiteu conèixer dues equacions: la imatge de la lent fina i les equacions d'ampliació:
1/f=1/si + 1/so
M=-si/so
f és la distància focal de la lent. Una distància focal més curta significa que la lent té més poder d'enfocament.
El mateix passa amb la distància d'objectes; la distància entre la lent i l'objecte (per exemple, un arbre).
si és la distància de la imatge; la distància entre la lent i on es forma la imatge
M és l'augment; quina mida és la imatge en relació a l'objecte. Per als microscopis, volem augmentar l'ampliació.
Per obtenir un tutorial complet sobre l'equació de la lent fina, mireu aquest vídeo de Khan Academia. Al gif de dalt, podeu veure que la distància que l'objecte s'acosta a la lent augmenta la distància de la imatge, la qual cosa augmenta l'ampliació. La línia vertical amb dues fletxes indica la lent.
