Beneficis de la microscòpia multifotònica d'escaneig làser millorats
El microscopi multifotòn d'escaneig làser és una millora important en la microscòpia òptica, principalment en la capacitat d'observar l'estructura profunda de cèl·lules i teixits vius i fixos, i d'obtenir estructures de pla Z multicapa clares i nítides, és a dir, rodanxes òptiques, a partir de les quals es pot construir una estructura sòlida tridimensional de l'exemplar. La microscòpia confocal utilitza una font de llum làser que s'expandeix per omplir tot el pla focal posterior de la lent de l'objectiu, i després passa pel sistema de lents de la lent objectiu per convergir en punts molt petits al pla focal de la mostra. Depenent de l'obertura numèrica de la lent de l'objectiu, la mida del diàmetre del punt d'il·luminació brillant és d'aproximadament 0,25 ~ 0,8 μm i la profunditat és d'aproximadament 0,5 ~ 1,5 μm. La mida del punt confocal ve determinada pel disseny del microscopi, la longitud d'ona del làser, les característiques de la lent de l'objectiu, la configuració de l'estat de la unitat d'escaneig i la naturalesa de la mostra. Els microscopis de camp tenen un gran rang d'il·luminació i profunditat d'il·luminació, mentre que els microscopis confocals concentren la il·luminació en un únic punt focal del pla focal. L'avantatge més bàsic d'un microscopi confocal és la capacitat de fer seccions òptiques fines d'espècimens fluorescents gruixuts (fins a 50 μm o més), amb gruixos de secció d'uns 0,5 a 1,5 μm. Es poden obtenir una sèrie d'imatges de secció òptica movent la mostra cap amunt i cap avall amb el motor pas a pas de l'eix Z del microscopi. L'adquisició d'informació d'imatge es controla en el primer pla i no es veu interferida pels senyals emesos des d'altres ubicacions de la mostra. Després d'eliminar els efectes de la fluorescència de fons i augmentar la relació senyal-soroll, el contrast i la resolució de la imatge confocal es milloren significativament respecte a les imatges de fluorescència il·luminades en camp convencionals. En molts exemplars, molts components estructurals intricats s'entrellacen per formar sistemes complexos, però un cop es poden adquirir prou seccions òptiques, podem reconstruir-les en tres dimensions mitjançant programari. Aquest mètode experimental s'ha utilitzat àmpliament en la investigació biològica per dilucidar les complexes relacions estructurals i funcionals entre cèl·lules o teixits.
