Característiques i aplicacions del microscopi confocal làser
Mentre que en un microscopi normal el pla d'imatge de l'observació s'aïlla dels plans axials veïns superposant el pla focal de la lent objectiu amb el detector, en un microscopi confocal aquest aïllament s'aconsegueix il·luminant la mostra amb un punt limitat de difracció de llum i filtrant la llum dispersa mitjançant l'ús d'un forat en el camí de la llum recollida en el focus conjugat d'aquest punt de llum per aconseguir aquest aïllament i així millorar la resolució.
Només la llum reflectida des de la capa de mostra conjugada pot passar a través del forat al trajecte de la col·lecció de llum, mentre que la resta de reflexos irrellevants de la capa de mostra estan bloquejades pel forat. Això dóna un augment significatiu de la resolució. A continuació es mostra una comparació paral·lela entre la microscòpia de fluorescència multidimensional i la microscòpia confocal de la mateixa mostra gruixuda. Quan es prenen una sèrie d'imatges en diferents plans focals, es produeix una imatge anomenada habitualment "pila z", que mostra els guanys de resolució i contrast proporcionats per la microscòpia confocal i les raons subjacents d'aquests guanys. Es pot veure que l'examen de la imatge a la part superior de la pila on el pla d'imatge està per sobre del teixit revela una gran quantitat de llum dispersa a la imatge de fluorescència, mentre que la imatge del microscopi confocal sembla negra. Aquesta reducció de PSF en la direcció axial contribueix directament a la diferència de resolució observada a la interfície òptica al mig de la pila z.
Imatge d'escaneig òptic de talls
Una altra característica de la microscòpia confocal d'escaneig làser és que és una tècnica d'imatges d'escaneig. Les tècniques tradicionals d'il·luminació de camp ampli il·luminen tota la mostra de manera que la imatge es pugui capturar directament a ull nu o un detector, però LSCM utilitza un o més feixos de llum enfocats per escanejar la mostra, de manera que la imatge resultant s'anomena òptica, tal com es mostra al diagrama següent. A continuació es mostra la diferència entre la il·luminació tradicional de camp ampli i la il·luminació confocal d'escaneig làser.
Per tant, a la figura següent es mostra una forma pràctica de microscòpia confocal moderna. La llum d'excitació del làser passa a través d'un mirall dicroic i s'escaneja a través d'un parell de miralls galvanòmetres en la direcció x i la direcció y de la mostra, i l'excitació (o reflexió) de la mostra passa per un forat al PMT. detector que s'ha de gravar i la imatge escanejada gravada és reconstruïda per un ordinador per produir una imatge real de la mostra.
