Coneixements sobre la microscòpia de fluorescència de dos-fotons
El principi bàsic de l'excitació de dos-fotons és que a una densitat de fotons elevada, les molècules fluorescents poden absorbir simultàniament dos fotons de longitud d'ona llarga i emetre un fotó de longitud d'ona més curta després d'un període curt de l'anomenat-vida útil de l'estat excitat; L'efecte és el mateix que utilitzar un fotó amb la meitat de la longitud d'ona de la longitud d'ona llarga per excitar molècules fluorescents. L'excitació de dos fotons requereix una alta densitat de fotons i, per evitar danys a les cèl·lules, la microscòpia de dos-fotons utilitza làsers de pols bloquejats en mode d'alta-energia-. El làser emès per aquest làser té una energia màxima alta i una energia mitjana baixa, amb una amplada de pols de només 100 femtosegons i una freqüència de fins a 80 a 100 megahertz. Quan s'utilitza una lent objectiu d'obertura numèrica alta per enfocar els fotons d'un làser polsat, la densitat de fotons al punt focal de la lent objectiu és la més alta i l'excitació de dos-fotons només es produeix al punt focal de la lent objectiu. Per tant, el microscopi de dos-fotons no requereix un forat confocal, cosa que millora l'eficiència de la detecció de fluorescència.
En els fenòmens de fluorescència generals, a causa de la baixa densitat de fotons de la llum d'excitació, una molècula fluorescent només pot absorbir un fotó a la vegada i després emetre un altre fotó fluorescent mitjançant la transició radiativa, que es coneix com a fluorescència de fotó únic. Per als processos d'excitació de fluorescència que utilitzen làsers com a fonts de llum, es poden produir fenòmens de fluorescència de dos-fotons o fins i tot multifotòns. En aquest cas, la font de llum d'excitació utilitzada té una gran intensitat i densitat de fotons que compleix el requisit perquè les molècules fluorescents absorbeixin dos fotons simultàniament. En el procés d'utilitzar un làser general com a font de llum d'excitació, la densitat de fotons encara és insuficient per produir el fenomen d'absorció de dos-fotons. Normalment, s'utilitzen làsers de pols de femtosegons, amb una potència instantània que arriba al nivell de megawatts. Per tant, la longitud d'ona de la fluorescència de dos-fotons és més curta que la de la llum d'excitació, equivalent a l'efecte produït per l'excitació de mitja longitud d'ona d'excitació.
