Introducció a la microscòpia de fluorescència
La microscòpia de fluorescència consisteix a irradiar l'objecte tacat amb fluoresceïna amb llum de longitud d'ona curta, de manera que s'excita per produir fluorescència de longitud d'ona llarga i després s'observa. En un microscopi de fluorescència, la llum d'excitació d'una longitud d'ona específica s'ha de seleccionar de la llum d'il·luminació de l'exemplar per generar fluorescència, i després la fluorescència s'ha de separar de la llum mixta de la llum d'excitació i la fluorescència per a l'observació. Per tant, el sistema de filtre juga un paper extremadament important a l'hora de seleccionar una longitud d'ona específica. Els microscopis de fluorescència s'utilitzen àmpliament en biologia, medicina i altres camps.
1. Els components principals del microscopi de fluorescència:
(A) Font de llum: la font de llum irradia llum de diverses longituds d'ona (des de l'ultraviolat fins a l'infraroig). el
(B) Font de llum del filtre d'excitació: a través de la llum d'una longitud d'ona específica que pot provocar que l'exemplar produeixi fluorescència, mentre bloqueja la llum que no serveix per excitar la fluorescència. el
(C) Espècimens fluorescents: generalment tenyits amb pigments fluorescents. el
(D) Filtre de bloqueig: bloqueja la llum d'excitació que no és absorbida per la mostra i transmet selectivament la fluorescència, i algunes longituds d'ona es transmeten selectivament a la fluorescència.
el
2. Classificació dels microscopis de fluorescència:
Els microscopis de fluorescència es divideixen generalment en dos tipus: transmissió i epiemissió:
a. Tipus de transmissió: la llum d'excitació prové de la part inferior de l'objecte a inspeccionar i el condensador és un condensador de camp fosc, de manera que la llum d'excitació no entra a la lent de l'objectiu, sinó que la fluorescència entra a la lent de l'objectiu. És brillant a pocs augments, però fosc a grans augments. És difícil d'operar en immersió i centratge d'oli. És especialment difícil determinar el rang d'il·luminació amb augments baixos, però pot obtenir un fons de camp de visió molt fosc. El tipus de transmissió no s'utilitza per a objectes no transparents. el
b. Tipus epi: el tipus de transmissió està gairebé eliminat actualment. La majoria dels nous microscopis de fluorescència són de tipus epi. La font de llum prové de la part superior de l'objecte que s'ha d'inspeccionar i hi ha un divisor de feix al camí òptic, per la qual cosa és adequat tant per a objectes transparents com opacs a inspeccionar. Atès que la lent de l'objectiu actua com una lent condensadora, no només és fàcil d'utilitzar, sinó que també pot aconseguir una il·luminació uniforme de tot el camp de visió des de baix augment fins a gran augment. el
el
3. Precaucions per a la fluoroscòpia
a. La irradiació a llarg termini de la llum d'excitació provocarà l'atenuació i l'extinció de la fluorescència, de manera que escurceu el temps d'observació tant com sigui possible i utilitzeu un deflector per cobrir la llum d'excitació quan no observeu temporalment. el
b. Quan observeu amb una lent d'immersió en oli, utilitzeu "oli no fluorescent". el
c. La fluorescència és gairebé sempre feble i s'ha de dur a terme en una habitació fosca. el
d. El millor és instal·lar un estabilitzador de tensió a la font d'alimentació, en cas contrari, la tensió inestable no només reduirà la vida útil de la làmpada de mercuri, sinó que també afectarà l'efecte de la inspecció del microscopi. el
el
4. Ús de la microscòpia de fluorescència
1. Requisits de preparació de mostres de microscopi de fluorescència
a. Porta de vidre
El gruix de la diapositiva de vidre ha d'estar entre 0,8 i 1,2 mm. Una diapositiva massa gruixuda absorbirà més llum d'una banda i, d'altra banda, la llum d'excitació no es pot concentrar a la mostra. Les diapositives han de ser llises, de gruix uniforme i lliures d'autofluorescència evident. De vegades s'utilitzen làmines de vidre de quars. el
b. Vidre cobert
El gruix de la coberta de vidre és d'aproximadament 0,17 mm, llisa. Per reforçar la llum d'excitació, també es pot utilitzar un vidre de coberta sec, que és un vidre de coberta especial recobert amb diverses capes de substàncies (com ara fluorur de magnesi) que tenen diferents efectes d'interferència sobre la llum de diferents longituds d'ona, que poden fer que el la fluorescència va sense problemes. La llum d'excitació passa a través i la llum d'excitació reflectida excita l'exemplar. el
c. Exemplar
Les rodanxes de teixit o altres exemplars no han de ser massa gruixudes. Si és massa gruixut, la major part de la llum d'excitació es consumirà a la part inferior de la mostra, mentre que la part superior observada directament per la lent de l'objectiu no es pot excitar completament. A més, la superposició de cèl·lules o les impureses s'encobrin, afectant el judici. el
d. Agent de muntatge
La glicerina s'utilitza habitualment com a agent de muntatge, que no ha de tenir autofluorescència, incolora i transparent, i la brillantor de la fluorescència és més brillant a pH 8.5-9,5, i no és fàcil esvair ràpidament. Per tant, com a agent de muntatge s'utilitza habitualment una barreja igual de glicerol i una solució tampó de carbonat de 0,5 mol/L amb un pH de 9,0 a 9,5. el
e. oli de mirall
En general, s'ha d'utilitzar oli d'immersió quan s'observen mostres amb microscopis de fluorescència de camp fosc i objectius d'immersió d'oli. El millor és utilitzar oli especial de mirall no fluorescent, que també es pot substituir per la glicerina esmentada anteriorment, i també es pot utilitzar parafina líquida, però l'índex de refracció és baix, cosa que afecta lleugerament la qualitat de la imatge.
