Observació de fluorescència al microscopi òptic
La fluorescència es refereix al procés en què una substància fluorescent emet llum amb una longitud d'ona més llarga gairebé simultàniament quan s'irradia amb llum d'una longitud d'ona específica (Figura 1). Quan la llum d'una longitud d'ona específica (longitud d'ona d'excitació) colpeja una molècula, com les d'un fluoròfor, l'energia del fotó és absorbida pels electrons de la molècula. A continuació, els electrons passen de l'estat fonamental (S0) a un nivell d'energia més alt, l'estat excitat (S1'). Aquest procés s'anomena excitació①. L'electró es manté en estat excitat durant 10-9–{10-8 segons, durant els quals l'electró perd una mica d'energia②. Durant el procés dels electrons que surten de l'estat excitat (S1) i tornen a l'estat fonamental③, s'allibera l'energia restant absorbida durant el procés d'excitació.
Diagrama de Jablonski fluorescent
El temps de residència de la molècula fluorescent en estat excitat és la vida útil de la fluorescència, que generalment es troba al nivell de nanosegons, i és una característica inherent a la pròpia molècula fluorescent. La fluorescència per a la vida d'imatges (FLIM), que utilitza la tecnologia d'imatge de fluorescència durant tota la vida, pot realitzar mesures funcionals més profundes a més de les imatges d'intensitat de fluorescència i obtenir conformació molecular, interaccions intermoleculars i el microentorn de les molècules, etc. Informació difícil d'obtenir obtenir amb imatges òptiques convencionals.
Una altra propietat important de la fluorescència és el desplaçament de Stokes, la diferència de longitud d'ona entre els pics d'excitació i d'emissió (figura 2). Normalment, la longitud d'ona d'emissió és més llarga que la longitud d'ona d'excitació. Això es deu al fet que els electrons perdran part de la seva energia a través del procés de relaxació després d'excitar la substància fluorescent i abans d'alliberar fotons. Les substàncies fluorescents amb desplaçaments de Stokes més grans són més fàcils d'observar amb un microscopi de fluorescència.
microscopi de fluorescència
El microscopi de fluorescència és un microscopi òptic que utilitza propietats de fluorescència per a l'observació i la imatge, i s'utilitza àmpliament en diversos camps com ara la biologia cel·lular, la neurobiologia, la botànica, la microbiologia, la patologia i la genètica. La imatge de fluorescència té els avantatges d'una alta sensibilitat i alta especificitat, i és molt adequada per a l'observació de la distribució de proteïnes i orgànuls específics en teixits i cèl·lules, l'estudi de la colocalització i la interacció, el seguiment de processos dinàmics de la vida com els canvis de concentració d'ions. , etc.
La majoria de molècules de les cèl·lules no fan fluorescència, i si les voleu veure, les marqueu amb fluorescència. Hi ha molts mètodes d'etiquetatge fluorescent, com ara l'etiquetatge directe (com l'ús de DAPI per etiquetar l'ADN), o la immunotinció utilitzant les propietats d'unió a l'antigen dels anticossos, o l'ús de proteïnes fluorescents (com ara GFP, proteïna fluorescent verda) per etiquetar proteïnes diana. , i enquadernació reversible. tints sintètics (com ara Fura-2), etc.
Microscopi de fluorescència invertida MF53-N
Actualment, el microscopi de fluorescència s'ha convertit en l'equip d'imatge estàndard de diversos laboratoris i plataformes d'imatge, i és un bon ajudant per als nostres experiments diaris. Els microscopis de fluorescència es divideixen principalment en tres categories: microscopis de fluorescència verticals (aptes per a la secció), microscopis de fluorescència invertida (adequats per a cèl·lules vives, tenint en compte la secció), estereoscopis fluorescents (adequats per a exemplars més grans, com ara plantes, peix zebra (adult/embrió). ), medaka, òrgans de ratolí/rata, etc.).
La tecnologia d'imatge de microscòpia de fluorescència s'utilitza àmpliament i és rica en tipus, i encara estan sorgint noves tecnologies. Podeu triar la tecnologia per completar la vostra pròpia recerca.
