Mètode de detecció per microscòpia de fluorescència
microscopi de fluorescència
La microscòpia de fluorescència és una eina fonamental per a la citoquímica d'immunofluorescència. Es compon de components principals com la font de llum, el sistema de plaques de filtre i el sistema òptic. Utilitza una certa longitud d'ona de llum per excitar la mostra i emetre fluorescència, que s'amplia mitjançant un sistema d'objectius i oculars per observar la imatge de fluorescència de la mostra (figura 1).
(1) Font de llum
Avui en dia, s'utilitza habitualment com a font de llum una làmpada de mercuri d'ultra alta pressió de 200 W. Està fet de vidre de quars, amb una forma esfèrica al mig i una certa quantitat de mercuri plena a l'interior. Durant el funcionament, la descàrrega entre els dos elèctrodes fa que el mercuri s'evapori i la pressió dins de l'esfera augmenta ràpidament. Quan el mercuri s'evapora completament, pot assolir 50-70 pressions atmosfèriques estàndard, que generalment triguen uns 5-15 minuts. La luminescència de les làmpades de mercuri d'ultra alta pressió és el resultat de la descàrrega entre elèctrodes, que contínuament es dissocia i redueix les molècules de mercuri i emet fotons. Emet una forta llum ultraviolada i blava violeta, que és suficient per excitar diverses substàncies fluorescents, per tant, s'utilitza àmpliament en microscopis de fluorescència.
Precaucions per utilitzar un microscopi de fluorescència
(1) Seguiu estrictament les instruccions de la fàbrica de microscopis de fluorescència i no canvieu el programa de manera arbitrària.
(2) La inspecció s'ha de dur a terme en una habitació fosca. Després d'entrar a la cambra fosca, connecteu l'alimentació i enceneu la làmpada de mercuri d'ultra alta pressió durant 5-15 minuts. Després que la font de llum emeti una llum intensa i s'estabilitzi, els ulls s'han d'adaptar completament a la cambra fosca abans de començar a observar l'exemplar.
(3) Per evitar danys UV als ulls, s'han de portar ulleres protectores quan s'ajusta la font de llum.
(4) El temps d'inspecció hauria de ser de 1-2 hores cada vegada. Si supera els 90 minuts, la intensitat lluminosa de la làmpada de mercuri d'ultra alta pressió disminueix gradualment i la fluorescència es debilita; Espècimens exposats a la radiació ultraviolada durant 3-5 dies
Després de min, la fluorescència també va disminuir significativament; Per tant, la durada màxima no ha de superar les 2-3 hores.
(5) La vida útil de la font de llum del microscopi fluorescent és limitada i l'exemplar s'ha d'examinar centralment per estalviar temps
Estalvieu temps i protegiu la font de llum. Quan fa calor, s'ha d'afegir un ventilador elèctric per dissipar la calor i refredar-se. Quan substituïu una bombeta nova, el temps d'ús s'ha de registrar des del principi. Quan la llum estigui apagada i la vulguis tornar a utilitzar, has d'esperar que la bombeta es refredi prou abans d'encendre-la. Eviteu encendre la font de llum diverses vegades al dia.
(6) Observeu la mostra immediatament després de la tinció, ja que la fluorescència es debilitarà gradualment amb el temps. Si la mostra s'emmagatzema en una bossa de plàstic de polietilè a 4 graus, pot retardar el temps d'atenuació de la fluorescència i evitar l'evaporació de l'agent de muntatge.
(7) Els criteris de judici per a la brillantor de la fluorescència es divideixen generalment en quatre nivells, és a dir, "un" - cap fluorescència o visible dèbil. "+" - Només és visible la fluorescència visible. ++- Visible amb fluorescència brillant. "+++": fluorescència visible i enlluernadora.
