Millorar els avantatges de la microscòpia multifotònica d'escaneig làser
La microscòpia multifotònica d'escaneig làser és una millora important respecte a la microscòpia òptica. Pot observar l'estructura profunda de cèl·lules vives, cèl·lules fixes i teixits, i pot obtenir estructures de pla Z multicapa clares i nítides, és a dir, seccions òptiques, a partir de les quals pot construir l'estructura sòlida tridimensional de l'exemplar. La microscòpia confocal utilitza una font de llum làser que, després de l'expansió, omple tot el pla focal posterior de la lent objectiu i després passa pel sistema de lents de la lent objectiu per convergir en un punt molt petit del pla focal de la mostra. Depenent de l'obertura numèrica de la lent de l'objectiu, el diàmetre del punt d'il·luminació més brillant és d'aproximadament 0.25 ~ 0.8μm i la profunditat és d'aproximadament 0.5 ~ 1.5μm . La mida del punt confocal depèn del disseny del microscopi, la longitud d'ona del làser, les característiques de la lent objectiva, la configuració d'estat de la unitat d'escaneig i les propietats de la mostra. La microscòpia de camp té un gran rang i profunditat d'il·luminació, mentre que la microscòpia confocal té una il·luminació enfocada centrada en un punt focal del pla focal. L'avantatge més bàsic de la microscòpia confocal és que pot realitzar una secció òptica fina de mostres fluorescents gruixudes (que poden arribar a 50 μm o més) i el gruix de les seccions és d'uns 0,5 a 1,5 μm. Es poden obtenir una sèrie d'imatges de secció òptica movent la mostra cap amunt i cap avall mitjançant el motor pas a pas de l'eix Z del microscopi. L'adquisició d'informació d'imatge es controla dins del pla i no es veurà interferida per senyals emesos des d'altres ubicacions de la mostra. Després d'eliminar la influència de la fluorescència de fons i augmentar la relació senyal-soroll, el contrast i la resolució de les imatges confocals es milloren significativament en comparació amb les imatges de fluorescència il·luminades en camp tradicionals. En molts exemplars, molts components estructurals complexos s'entrellacen per formar sistemes complexos, però un cop es poden recollir prou seccions òptiques, podem reconstruir-les en tres dimensions mitjançant programari. Aquest mètode experimental s'ha utilitzat àmpliament en la investigació biològica per dilucidar les complexes relacions estructurals i funcionals entre cèl·lules o teixits.
