Recompte directe de microorganismes amb un microscopi
Principi experimental
El recompte directe sota un microscopi mitjançant un hemocitòmetre és un mètode de recompte microbià d'ús habitual. L'avantatge d'aquest mètode és que és intuïtiu i ràpid. Col·loqueu la suspensió bacteriana (o suspensió d'espores) adequadament diluïda a la cambra de recompte entre el portaobjectes i el vidre de coberta de l'hemocitòmetre i comptar al microscopi. Com que el volum de la cambra de recompte és fix (0,1 mm2), es pot convertir en el nombre total de microorganismes per unitat de volum segons el nombre de microorganismes observats al microscopi. Com que aquest mètode compta la suma de bacteris vius i morts, també s'anomena mètode de recompte total de bacteris.
Un hemocitòmetre sol ser un portaobjectes de vidre especial sobre el qual quatre solcs formen tres plataformes. La plataforma del mig està dividida en dues meitats per un solc horitzontal curt. Una quadrícula està gravada a la plataforma a cada costat. Cada graella està dividida en nou quadrats grans. La gran plaça del mig és la sala de recompte. Els microorganismes es compten a la cambra de recompte. L'estructura del tauler de recompte de cèl·lules sanguínies es mostra a la figura Ⅷ-1.
L'escala de la sala de recompte generalment té dues especificacions, una és que un quadrat gran es divideix en 16 quadrats mitjans i cada quadrat central es divideix en 25 quadrats petits (figura Ⅷ-2); l'altre és un gran quadrat. El quadrat es divideix en 25 quadrats mitjans i cada quadrat central es divideix en 16 quadrats petits (figura Ⅷ-1, C). Però independentment del tipus de tauler de recompte que sigui, el nombre de quadrats petits a cada quadrat gran és el mateix, és a dir, 16×25=400 quadrats petits, tal com es mostra a la figura Ⅷ-2.
La longitud lateral de cada quadrat gran és d'1 mm i l'àrea de cada quadrat gran és d'1 mm2. Un cop cobert el vidre de la coberta, l'alçada entre el vidre lliscant i el vidre de la coberta és de 0,1 mm, de manera que el volum de la cambra de recompte és de 0,1 mm3.
En comptar, normalment es compta el nombre total de bacteris a les cinc quadrícules centrals, després obteniu el valor mitjà de cada quadrícula central i, a continuació, multipliqueu per 16 o 25 per obtenir el nombre total de bacteris en una graella gran i, a continuació, convertiu-lo al nombre total de bacteris en 1 ml de solució bacteriana.
Equip de laboratori
Hemocitòmetre, microscopi, cobreobjectes, capil·lar estèril;
Materials experimentals
Suspensió de Saccharomyces cerevisiae
Procediment experimental (mètode de recompte directe al microscopi microbià)
1. dilució
Diluir adequadament la suspensió de Saccharomyces cerevisiae. Si la solució bacteriana no és espessa, no cal diluir-la.
2. Sala de recompte microscòpica
Abans d'afegir mostres, feu una inspecció microscòpica de la cambra de recompte de la placa de recompte. Si hi ha brutícia, cal netejar-la abans de comptar.
3. afegir mostra
Cobriu la placa d'hemocitòmetre neta i seca amb una coberta de vidre i, a continuació, utilitzeu un comptagotes estèril de boca fina per deixar caure una petita gota de la solució diluïda de Saccharomyces cerevisiae des de la vora de la coberta de vidre (no massa), de manera que la solució de bacteris està a prop del buit al llarg del buit. L'osmosi capil·lar entra per si mateixa a la cambra de recompte i la cambra de recompte general es pot omplir de líquid bacterià. Aneu amb compte de no tenir bombolles d'aire.
4. recompte al microscopi
Després de descansar durant 5 minuts, col·loqueu l'hemocitòmetre a l'escenari del microscopi, utilitzeu primer una lent de baixa potència per trobar la ubicació de la cambra de recompte i, a continuació, canvieu a una lent d'alta potència per comptar. Si es constata que la solució bacteriana és massa espessa o massa prima abans de comptar, cal reajustar la dilució abans de comptar. En general, la dilució de la mostra requereix uns 5-10 bacteris a cada cèl·lula. Cada cambra de recompte selecciona els bacteris en 5 quadrícules centrals (opcionals 4 cantonades i quadrícules centrals) per comptar. Els bacteris de la línia de la quadrícula generalment només es compten a les línies superior i dreta. En cas de brotació del llevat, quan la mida del cos del brot arriba a la meitat de la cèl·lula mare, comptar dos bacteris. Compteu una mostra per calcular el contingut bacterià de la mostra a partir dels valors comptats a les dues cambres de recompte.
5. Neteja de l'Hemocitòmetre
Després de l'ús, esbandiu la placa de recompte de cèl·lules sanguínies a l'aixeta amb raigs d'aigua, no la renteu amb objectes durs i assequeu-la sol o amb un assecador de cabells després del rentat. Examen microscòpic, observar si hi ha bacteris residuals o altres sediments a cada cèl·lula. Si no està net, s'ha de rentar repetidament fins que estigui net.
