Diferències i característiques entre el microscopi de fluorescència i el microscopi òptic ordinari
El microscopi de fluorescència és diferent del microscopi òptic normal. No observa l'exemplar mitjançant la il·luminació de la font de llum ordinària. En comptes d'això, utilitza llum d'una certa longitud d'ona (generalment llum ultraviolada, llum blava-violada) per excitar el material fluorescent de l'exemplar sota el microscopi, fent que emeti fluorescència. Per tant, la font de llum d'un microscopi de fluorescència no serveix com a il·luminació directa, sinó com a font d'energia que excita el material fluorescent intern de la mostra. El motiu pel qual podem observar l'exemplar no es deu a la il·luminació de la font de llum, sinó al fenomen de fluorescència causat pel material fluorescent de la mostra que absorbeix l'energia lluminosa excitada. Es pot veure que la característica principal d'un microscopi de fluorescència és que la seva font de llum pot subministrar una gran quantitat de llum d'excitació en un rang de longitud d'ona específic, de manera que les substàncies fluorescents de l'exemplar examinat poden obtenir la intensitat necessària de llum d'excitació. Al mateix temps, els microscopis de fluorescència han de tenir els sistemes de filtre corresponents. La microscòpia de fluorescència és una eina essencial per a la histoquímica de fluorescència avançada. Es compon de font de llum d'ultra-alta pressió, sistema de filtre (incloses plaques de filtre d'excitació i supressió), sistema òptic i sistema de fotografia. Utilitza llum d'una certa longitud d'ona per excitar l'espècimen perquè emeti fluorescència.
1. Maneres d'excitar la fluorescència: Segons el rang de longitud d'ona de la llum, es divideix en dos tipus: mètode d'excitació UV (utilitzant el mètode d'il·luminació ultraviolada) i mètode d'excitació BV (utilitzant llum blava-violada). El mètode d'excitació UV utilitza llum gairebé ultraviolada de menys de 400 nm per a l'excitació. No hi ha llum d'excitació visible en aquest mètode, de manera que la fluorescència observada mostra la fluorescència inherent del colorant, cosa que facilita la distinció de la fluorescència específica de la mostra de l'autofluorescència del teixit de fons.
2. Mètode d'excitació BV: excitació de la llum ultraviolada a la blava centrada a 404 nm i 434 nm. Aquest mètode utilitza llum blava per il·luminar la mostra, de manera que el filtre de tall del sistema d'observació de fluorescència ha d'utilitzar un filtre que pugui bloquejar completament la llum blava i passar completament la fluorescència verda i groga necessària. Colorants fluorescents utilitzats en mètodes d'anticossos fluorescents. La longitud d'ona d'absorció màxima de la llum d'excitació i la longitud d'ona màxima d'emissió de fluorescència són relativament properes, de manera que el filtre utilitzat en el mètode d'excitació BV ha d'utilitzar un filtre de tall nítid. Aquest mètode pot utilitzar llum blava com a llum d'excitació, de manera que l'eficiència d'absorció dels pigments fluorescents és més alta i es poden obtenir imatges més brillants. El desavantatge és que la fluorescència per sota de 500 nm no es pot veure, mentre que la fluorescència per sobre de 500 nm fa que tota la imatge sembli groga. En el mètode d'anticossos fluorescents, l'especificitat del colorant fluorescent es jutja principalment pel seu color únic. Per tant, quan es parla de l'especificitat subtil, les deficiències esmentades anteriorment del mètode d'excitació BV sovint tenen un gran impacte.
