Diferència entre el microscopi de fluorescència i el microscopi normal
1. Mira el mètode d'il·luminació
El mètode d'il·luminació del microscopi de fluorescència és generalment de tipus epi, és a dir, la font de llum es col·loca a la mostra de prova a través de la lent de l'objectiu.
2. Mira la resolució
Els microscopis de fluorescència utilitzen llum ultraviolada com a font de llum, amb una longitud d'ona relativament curta, però la resolució és superior a la dels microscopis òptics ordinaris.
3, la diferència en el filtre
El microscopi de fluorescència utilitza dos filtres especials, que s'utilitzen davant de la font de llum per filtrar la llum visible i s'utilitzen entre la lent de l'objectiu i l'ocular per filtrar la llum ultraviolada, que pot protegir els ulls humans.
El microscopi de fluorescència també és un tipus de microscopi òptic, principalment perquè la longitud d'ona excitada pel microscopi de fluorescència és curta, de manera que això comporta la diferència en l'estructura i l'ús del microscopi de fluorescència i el microscopi normal. La majoria dels microscopis de fluorescència tenen una bona funció de captar llum feble. , així que sota una fluorescència extremadament feble, la seva capacitat d'imatge també és bona. Juntament amb la millora contínua de la microscòpia de fluorescència en els darrers anys, el soroll també s'ha reduït molt. Per tant, cada cop s'utilitzen més microscopis de fluorescència.
Coneixements de microscòpia de fluorescència de dos fotons
El principi bàsic de l'excitació de dos fotons és: en el cas d'alta densitat de fotons, les molècules fluorescents poden absorbir dos fotons de longitud d'ona llarga al mateix temps i, després d'una vida molt curta, l'anomenat estat excitat, emeten un fotó de longitud d'ona curta. ; l'efecte és el mateix que utilitzar un fotó amb una longitud d'ona la meitat de la longitud d'ona llarga per excitar una molècula fluorescent. L'excitació de dos fotons requereix una alta densitat de fotons i, per no danyar les cèl·lules, la microscòpia de dos fotons utilitza làsers polsats bloquejats en mode d'alta energia. Aquest làser emet llum làser amb una energia màxima alta i una energia mitjana baixa, amb una amplada de pols de només 100 femtosegons i una freqüència de 80 a 100 MHz. Quan s'utilitza una lent objectiu d'obertura numèrica alta per enfocar els fotons del làser polsat, la densitat de fotons al punt focal de la lent objectiu és la més alta i l'excitació de dos fotons es produeix només al punt focal de la lent objectiu, de manera que el microscopi de dos fotons no necessita un forat confocal, cosa que millora l'eficiència de detecció de fluorescència.
En el fenomen de fluorescència general, a causa de la baixa densitat de fotons de la llum d'excitació, una molècula fluorescent només pot absorbir un fotó al mateix temps i després emetre un fotó fluorescent a través de la transició de radiació, que s'anomena fluorescència d'un sol fotó. Per al procés d'excitació de fluorescència amb làser com a font de llum, es pot produir un fenomen de fluorescència de dos fotons o fins i tot de múltiples fotons. En aquest moment, la intensitat de la font de llum d'excitació utilitzada és alta i la densitat de fotons compleix el requisit que la molècula fluorescent absorbeixi dos fotons alhora. En el procés d'utilitzar un làser general com a font de llum d'excitació, la densitat de fotons encara no és suficient per produir una absorció de dos fotons. Normalment, s'utilitza un làser polsat de femtosegon, i la seva potència instantània pot arribar a l'ordre de megawatts. Per tant, la longitud d'ona de la fluorescència de dos fotons és més curta que la longitud d'ona de la llum d'excitació, que és equivalent a l'efecte produït per l'excitació de la longitud d'ona de mitja excitació.
La microscòpia de fluorescència de dos fotons té molts avantatges:
1) La llum de longitud d'ona llarga es veu menys afectada per la dispersió que la llum de longitud d'ona curta i pot penetrar fàcilment a l'exemplar;
2) Les molècules fluorescents fora del pla focal no s'exciten, de manera que més llum d'excitació pot arribar al pla focal, de manera que la llum d'excitació pugui penetrar mostres més profundes;
3) La llum propera a l'infraroig de longitud d'ona llarga és menys tòxica per a les cèl·lules que la llum de longitud d'ona curta;
4) Quan es veuen mostres amb microscòpia de dos fotons, el fotoblanqueig i la fototoxicitat només estan presents al pla focal. Per tant, la microscòpia de dos fotons és més adequada per veure exemplars gruixuts que la microscòpia d'un sol fotó, per veure cèl·lules vives o per realitzar experiments de fotoblanqueig de punt fix.
Coneixements de microscòpia de fluorescència confocal
El principi bàsic de la microscòpia de fluorescència confocal: utilitzant una font de llum puntual per il·luminar la mostra, es forma un petit punt de llum amb un contorn ben definit al pla focal. constituït pel divisor de feix. El divisor de feix envia la fluorescència directament al detector. Hi ha un forat al davant de la font de llum i el detector, respectivament anomenat forat d'il·luminació i forat de detecció. Les dimensions geomètriques dels dos són les mateixes, uns 100-200 nm; en relació amb el punt de llum del pla focal, els dos estan conjugats, és a dir, el punt de llum passa per una sèrie de lents i, finalment, es pot enfocar al forat d'il·luminació i al forat de detecció al mateix temps. D'aquesta manera, la llum del pla focal es pot concentrar dins del rang del forat de detecció, mentre que la llum dispersa des de dalt o per sota del pla focal queda bloquejada fora del forat de detecció i no es pot visualitzar. La mostra s'escaneja punt per punt amb el làser, i el tub fotomultiplicador després de detectar el forat també obté la imatge confocal del punt de llum corresponent punt per punt, que es converteix en un senyal digital i es transmet a l'ordinador, i finalment s'agrega en la pantalla en una imatge confocal clara de tot el pla focal. .
Cada imatge del pla focal és en realitat una secció transversal òptica de l'exemplar, i aquesta secció transversal òptica sempre té un cert gruix, també conegut com a rodanxa òptica. Com que la intensitat de la llum al punt focal és molt més gran que la del punt no focal, i la llum del pla no focal es filtra pel forat, la profunditat de camp del sistema confocal és aproximadament zero i l'exploració al llarg del L'eix Z pot realitzar tomografia òptica, formant l'Observeu una secció òptica bidimensional al punt enfocat de la mostra. Combinant l'exploració del pla XY (pla focal) amb l'escaneig de l'eix Z (eix òptic), acumulant imatges bidimensionals de capes successives i processant-les mitjançant un programari informàtic especial, es pot obtenir una imatge tridimensional de la mostra.
És a dir, el forat de detecció i el forat de la font de llum sempre estan enfocats al mateix punt, de manera que la fluorescència excitada fora del pla d'enfocament no pot entrar al forat de detecció.
L'expressió senzilla del principi de funcionament del làser confocal és que utilitza un làser com a font de llum i, sobre la base de la imatge tradicional del microscopi de fluorescència, s'adjunten un dispositiu d'escaneig làser i un dispositiu d'enfocament conjugat i l'adquisició i processament d'imatges digitals. sistema controlat per un ordinador.
