Coneixement del microscopi de fluorescència confocal
El principi bàsic de la microscòpia de fluorescència confocal: s'utilitza una font de llum puntual per irradiar la mostra, formant un punt de llum petit i ben definit al pla focal; la fluorescència emesa des d'aquest punt després de la irradiació és recollida per la lent de l'objectiu i enviada de nou al llarg del camí de la llum d'irradiació original fins al divisor de feix que consisteix en un mirall cromàtic bidireccional. El divisor de feix envia la fluorescència directament al detector. Tant la font de llum com el detector tenen cadascun un forat al davant, anomenat forat d'il·luminació i forat de detecció, respectivament. Tots dos tenen la mateixa geometria, uns 100-200 nm, i es conjuguen respecte al punt de llum en el pla focal, és a dir, el punt de llum passa per una sèrie de lents i, finalment, es pot enfocar tant en el i forats de detector. D'aquesta manera, la llum del pla focal pot convergir dins de l'obertura de la sonda, mentre que la llum dispersa des de dalt o per sota del pla focal es bloqueja fora de l'obertura de la sonda i no es pot capturar. El làser escaneja la mostra punt per punt, i el tub fotomultiplicador després de detectar el forat també obté la imatge confocal del punt de llum corresponent punt per punt, que es converteix en un senyal digital i es transmet a l'ordinador, i finalment convergeix en un clar imatge confocal de tot el pla focal a la pantalla.
Cada imatge del pla focal és en realitat una secció transversal òptica de la mostra, i aquesta secció transversal òptica sempre té un cert gruix, també conegut com a làmina òptica. Atès que la intensitat de la llum al punt focal és molt més gran que la del punt no focal, i la llum del pla no focal es filtra pel forat, la profunditat de camp del sistema confocal s'aproxima a zero i l'escaneig al llarg de la direcció de l'eix Z permet que la tomografia òptica formi una porció òptica bidimensional de l'exemplar que s'observa al punt focal. Combinant l'escaneig del pla XY (pla focal) amb l'escaneig de l'eix Z (eix òptic), es pot obtenir una imatge tridimensional de la mostra acumulant capes successives d'imatges bidimensionals, que són processades per programari informàtic especialitzat.
Això vol dir que el forat de detecció i el forat de la font de llum sempre estan enfocats al mateix punt, de manera que la fluorescència excitada fora del pla focal no pot entrar al forat de detecció.
El principi de funcionament del làser confocal s'expressa simplement que utilitza làser com a font de llum, sobre la base de la imatge tradicional del microscopi de fluorescència, un dispositiu d'escaneig làser addicional i un dispositiu d'enfocament conjugat, mitjançant el control informàtic per dur a terme un sistema d'adquisició i processament d'imatges digitals.
