Comparació entre microscopi confocal i microscopi òptic ordinari
Microscopi òptic general
El microscopi biològic general consta de tres parts, a saber: ① sistema d'il·luminació, inclosa la font de llum i el condensador; ② El sistema d'amplificació òptica, que consisteix en una lent objectiu i un ocular, és el cos principal del microscopi. Per tal d'eliminar l'aberració esfèrica i l'aberració cromàtica, tant l'ocular com la lent objectiu estan compostes per grups de lents complexos; (3) dispositiu mecànic, utilitzat per fixar materials i observació convenient.
Que la imatge del microscopi sigui clara o no depèn no només de l'ampliació, sinó també de la resolució del microscopi. La resolució es refereix a la capacitat del microscopi (o del lloc on els ulls humans estan a 25 cm de distància de l'objectiu) per distingir el petit interval de l'objecte zui. La resolució depèn de la longitud d'ona de la llum, la relació d'obertura i l'índex de refracció del medi, que s'expressa amb la fórmula:
R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsin /2
On: n= índex de refracció del medi;=angle de mirall (l'angle d'obertura de la mostra respecte a l'obertura de la lent) i NA= obertura numèrica. L'angle del mirall és sempre inferior a 180? Per tant, el valor zui de sina/2 ha de ser inferior a 1.
L'índex de refracció del vidre utilitzat per fer lents òptiques és d'1,65 ~ 1,78, i l'índex de refracció del medi utilitzat és més proper al del vidre, millor. Per a la lent objectiu seca, el medi és l'aire i la relació d'obertura és generalment 0.05 ~ 0,95; La lent d'oli utilitza asfalt fragant com a mitjà i la velocitat d'obertura de la lent pot ser propera a 1,5.
La longitud d'ona de la llum ordinària és de 400~700nm, de manera que la resolució del microscopi no és inferior a 0,2 μm i la resolució de l'ull humà és de 0,2 mm, de manera que la gran ampliació de zui dissenyada per El microscopi general sol ser 1000X x.
Per què necessites un microscopi confocal?
1. El microscopi òptic s'ha perfeccionat gràcies als esforços i la millora dels nostres grans predecessors. De fet, els microscopis normals ens poden proporcionar imatges microscòpiques boniques de manera senzilla i ràpida. No obstant això, va passar un esdeveniment que va portar una innovació revolucionària a aquest món quasi perfecte del microscopi, que és la invenció del "microscopi confocal d'exploració làser". Aquest nou microscopi es caracteritza per adoptar un sistema òptic que només extreu la informació de la imatge en el pla on es concentra el focus, i per restaurar la informació obtinguda a la memòria de la imatge mentre es canvia el focus, de manera que una imatge vívida amb informació tridimensional completa. es pot obtenir. Amb aquest mètode, es pot obtenir simplement informació sobre la forma de la superfície que no es pot confirmar amb microscopis normals. A més, per als microscopis òptics ordinaris, "millorar la resolució" i "aprofundir en la profunditat d'enfocament" són condicions contradictòries, especialment a gran augment, però per als microscopis confocals, aquest problema està resolt.
2. Avantatges del sistema òptic confocal
El sistema òptic confocal il·lumina el punt de mostra i la llum reflectida també és rebuda pels receptors puntuals. Quan la mostra es col·loca a la posició de focus, gairebé tota la llum reflectida pot arribar al fotoreceptor, però quan la mostra es desvia del focus, la llum reflectida no pot arribar al fotoreceptor. És a dir, en el sistema òptic confocal només s'emetrà la imatge que coincideixi amb el focus, i es blindarà la fàcula i la llum dispersa inútil.
3. Per què utilitzar un làser?
En el sistema òptic confocal, la mostra s'il·lumina i la llum reflectida també és rebuda per un fotoreceptor puntual. Per tant, la font de llum puntual es fa necessària. El làser pertany a una font de llum molt puntual. En la majoria dels casos, la font de llum del microscopi confocal adopta una font de llum làser. A més, les característiques del làser, com ara la monocromaticitat, la directivitat i la forma del feix excel·lent, també són motius importants per al seu ampli ús.
4. L'observació en temps real basada en l'escaneig d'alta velocitat es fa possible.
En l'escaneig làser, el deflector òptic acústic (element principal AO) s'utilitza en direcció horitzontal i el mirall Servo Galvano s'utilitza en direcció vertical. Com que no hi ha cap part de vibració mecànica a la unitat de deflexió òptica acústica, es pot escanejar a gran velocitat i és possible observar en temps real a la pantalla de monitorització. L'alta velocitat d'aquesta càmera és un projecte molt important que afecta directament la velocitat d'enfocament i la recuperació de la posició.
5. Relació entre la posició del focus i la brillantor
Al sistema òptic confocal, quan la mostra es col·loca correctament a la posició d'enfocament, la brillantor és gran, i abans i després, la seva brillantor baixarà bruscament (línia sòlida a la figura 4). Aquesta selectivitat sensible del pla focal també és el principi de mesurar la direcció de l'alçada del microscopi confocal i ampliar la profunditat focal. En canvi, el microscopi òptic ordinari no té un canvi de brillantor evident abans i després de la posició del focus (línia de punts a la figura 4).
6. Alt contrast i alta resolució
Al microscopi òptic general, la llum reflectida que es desvia del focus interferirà i es solaparà amb la part de la imatge del focus, reduint així el contrast de la imatge. En canvi, en el sistema òptic confocal, la llum dispersa fora del focus i la llum dispersa dins de la lent de l'objectiu s'eliminen gairebé completament, de manera que es pot obtenir una imatge amb un contrast molt elevat. A més, com que la llum travessa la lent de l'objectiu dues vegades, la imatge puntual s'afina primer i també es millora la resolució del microscopi.
7. Funció de localització òptica
En el sistema òptic confocal, la llum reflectida de la part diferent del punt focal està protegida per microporus. Per tant, en observar una mostra tridimensional, es forma una imatge com la formada després de tallar la mostra amb el focus (figura 5). Aquest efecte s'anomena localització òptica, que pertany a una de les especialitats del sistema òptic confocal.
8. Focalitzar la funció de memòria en moviment
L'anomenada llum reflectida fora del focus està protegida pels microporus. D'altra banda, es pot considerar que tots els punts de la imatge que forma el sistema òptic confocal coincideixen amb el focus. Per tant, si la mostra tridimensional es mou al llarg de la direcció de l'eix Z (eix òptic), la imatge s'acumularà i s'emmagatzemarà a la memòria i, finalment, zui obtindrà la imatge formada per la coincidència de tota la mostra i el focus. . D'aquesta manera, la funció de profunditat infinita de focus s'anomena funció de memòria mòbil.
9. Funció de mesura de la forma de la superfície
A la funció de moviment del focus, la forma de la superfície de la mostra es pot mesurar sense contacte afegint un bucle de registre d'alçada. A partir d'aquesta funció, és possible registrar les coordenades de l'eix Z formades pel gran valor de brillantor de zui a cada píxel i, a partir d'aquesta informació, es pot obtenir la informació relacionada amb la forma de la superfície de la mostra.
10. Funció de mesura de micro-mida d'alta precisió
La unitat receptora de llum adopta un sensor d'imatge CCD unidimensional, de manera que no es pot veure afectat per la inclinació d'escaneig del dispositiu d'escaneig, de manera que es pot completar la mesura d'alta precisió. A més, com que s'adopta la funció de memòria de moviment del focus amb profunditat d'enfocament ajustable al mateix temps, es pot eliminar l'error de mesura causat pel desplaçament del focus.
11. Anàlisi d'imatges tridimensionals
Mitjançant la funció de mesura de la forma de la superfície, es pot fer fàcilment la imatge tridimensional de la superfície de la mostra. No només això, sinó que també es poden dur a terme molts tipus d'anàlisi, com ara: mesura de rugositat superficial, àrea, volum, superfície, circularitat, radi, longitud de zui, perímetre, centre de gravetat, imatge tomogràfica, transformada FFT, línia mesura d'amplada i així successivament.
El microscopi d'exploració confocal làser es pot utilitzar no només per observar la morfologia cel·lular, sinó també per a l'anàlisi quantitativa dels components bioquímics de les cèl·lules, les estadístiques de densitat òptica i la mesura de la morfologia cel·lular.
