Estructura bàsica de la microscòpia de fluorescència confocal
(1) Mòdul d'escaneig
El mòdul d'escaneig consisteix principalment en una barra de llum estenopeica (que controla el gruix de les rodanxes òptiques), un espectroscopi (que canvia la direcció de propagació de la llum segons la longitud d'ona), un colorímetre de fluorescència d'emissió (seleccionant la llum dins d'un determinat rang de longitud d'ona per a la detecció) i un detector (tub fotomultiplicador). La fluorescència mixta de la mostra fluorescent entra a l'escàner i, després de ser seleccionada per la barra de llum, l'espectròmetre i el colorímetre de detecció, es divideix en diverses fluorescències monocromàtiques, que es detecten en diferents canals de fluorescència i formen imatges confocals corresponents. Al mateix temps, es poden mostrar diverses imatges de fluorescència monocromàtiques paral·leles i les seves imatges compostes a la pantalla de l'ordinador.
(2) Sistema de microscòpia de fluorescència
El microscopi és el component principal de LSCM, que està relacionat amb la qualitat d'imatge del sistema. El camí òptic del microscopi es pot inserir fàcilment en un sistema òptic infinitament distant amb opcions òptiques sense afectar la qualitat de la imatge i la precisió de la mesura. L'objectiu hauria de ser un objectiu apocromàtic de camp pla d'obertura numèrica gran, que és beneficiós per a l'adquisició de fluorescència i imatges clares. La conversió del grup de lents objectius, la selecció del grup de filtres de color, l'ajust del moviment de l'escenari i el bloqueig de memòria del pla focal han de ser controlats automàticament per l'ordinador.
El microscopi de fluorescència utilitzat en la microscòpia confocal d'escaneig làser és generalment el mateix que un microscopi de fluorescència convencional, però té les seves pròpies característiques: cal connectar-se a un escàner, perquè el làser pugui entrar a l'objectiu del microscopi per irradiar la mostra i fer la fluorescència emesa per la mostra arriba al detector; Es requereix un dispositiu de conversió de la trajectòria de la llum, que converteix les làmpades de mercuri en làsers i es pot ajustar la intensitat de la llum de la làmpada de mercuri.
(3) Làsers comuns
Les fonts làser utilitzades en la microscòpia confocal d'escaneig làser inclouen sistemes làser únic i multi làser, i els làsers d'ús habitual inclouen els tres tipus següents:
Làser semiconductor: 405 nm (línia espectral ultraviolada prop)
Làser d'ions d'argó: 457nm, 477nm, 488nm, 514nm (llum verda blava)
Làser He-Ne: 543nm (làser verd He-Ne de llum verda) 633nm (làser vermell He-Ne de llum vermella)
Làser UV (làser UV): 351 nm, 364 nm (llum UV)
(4) Equips auxiliars
Sistemes de refrigeració refrigerats per aire, refrigerats per aigua i fonts d'alimentació regulades.
El principi bàsic de funcionament d'un microscopi confocal d'escaneig làser és emetre primer una certa longitud d'ona de llum d'excitació del làser. Després de l'amplificació, la llum passa a través de la barra de llum estenopeica il·luminada de l'escàner per formar una font de llum puntual. La lent de l'objectiu se centra en el pla focal de la mostra i els punts il·luminats corresponents de la mostra s'exciten i emeten fluorescència. Després de passar per la barra de llum del forat de detecció, arriba al detector i s'imatge a la pantalla de monitorització de l'ordinador. D'aquesta manera, es forma una imatge confocal completa per les imatges de fluorescència de cada punt de la mostra en el pla focal, que s'anomena tall de llum.
