Aplicació de la microscòpia de fluorescència de reflexió interna total de fluorescència
TIRFM (Microscopi de fluorescència de reflexió interna total), microscopi de fluorescència de reflexió interna total, quan la llum entra en un medi amb un índex de refracció més baix des d'un medi amb un índex de refracció elevat, si l'angle d'incidència és prou gran, tota la llum es reflecteix sense refracció, però a La interfície dels dos mitjans produeix ones evanescents que poden excitar la fluorescència a 100 nm a prop de la interfície per realitzar l'observació de la superfície de l'objecte. La llum d'excitació es pot enviar a través de l'il·luminador d'un microscopi de fluorescència convencional o un il·luminador especial, i es pot controlar l'angle d'incidència del làser. El mètode d'excitació de camp instantani s'utilitza per evitar que la llum d'excitació entri al detector. La llum d'excitació a la interfície entre el vidre i l'aigua produeix un interior complet implementat per reflexió. A causa de l'atenuació exponencial de la llum d'excitació, només l'àrea de mostra molt propera a la superfície de reflexió total produirà reflex de fluorescència, la qual cosa redueix molt la interferència del soroll de la llum de fons a l'objectiu d'observació, de manera que aquesta tecnologia s'utilitza àmpliament en l'observació dinàmica. de substàncies de la superfície cel·lular.
Diagrama esquemàtic de la microscòpia de fluorescència de reflexió interna total (TIRFM)
①Mostra ②Range d'ones evanescents ③Coberta de vidre ④Immersió en oli ⑤Diana ⑥Feix d'emissió (senyal) ⑦Feix d'excitació
Per aconseguir una reflexió interna total, es requereix un angle d'incidència gran, per exemple, l'angle d'incidència a la interfície vidre-aigua és superior a 61 graus. Això es pot aconseguir mitjançant un prisma, anomenat TIRFM basat en prismes, o amb una lent objectiu amb una obertura numèrica elevada, que s'anomena TIRFM de tipus objectiu. Els microscopis de fluorescència de reflexió interna total comercialitzats actualment són generalment del tipus de lents objectius, amb alta velocitat i alta precisió.
La microscòpia de fluorescència de reflexió interna total s'utilitza àmpliament en alguns camps biològics perquè pot realitzar observacions de fluorescència en un rang molt prim (menys de 100 nm) a la superfície dels objectes. Com ara les aplicacions següents:
Observació d'imatges de la superfície cel·lular: estructura de la superfície de la membrana cel·lular, contacte amb la superfície cel·lular, dinàmica de la superfície de la membrana/localització de proteïnes.
Observació i manipulació d'una sola molècula: ATP marcat amb miosina, actina i Cy3-.
Moviment de la superfície de la membrana cel·lular: com ara l'embolic de vesícules, l'exhalació de les vesícules i les vesícules exocrines. el
Observació del fenomen d'espurna de calci a la membrana cel·lular, monitorització de canals iònics.
Recerca de motors moleculars: motors de rotació, proteïnes del citoesquelet, polímers, proteïnes G, proteïnes en anell, motors nucleòtids.
A més del camp de la biologia, també té bones aplicacions en el camp de la química per a l'observació d'estructures moleculars químiques.
