Una comparació de diferents tècniques de microscòpia de superresolució
Per a la microscòpia de llum convencional, la difracció de la llum limita la resolució d'imatges a aproximadament 250 nm. Avui dia, les tècniques de superresolució poden millorar-ho en més d'un factor de 10. Aquesta tècnica s'aconsegueix principalment mitjançant tres mètodes: microscòpia de localització d'una sola molècula, inclosa la microscòpia de localització fotosensible (PALM) i la microscòpia de reconstrucció òptica estocàstica (STORM); microscòpia d'il·luminació estructurada (SIM); i microscòpia d'esgotament d'emissions estimulades (STED). Com triar la tecnologia de superresolució és el que interessa a tothom. "Desafortunadament, no hi ha principis senzills per decidir quin mètode utilitzar", diu Mathew Stracy, investigador postdoctoral de la Universitat d'Oxford, Regne Unit. "Cadascuna té els seus propis avantatges i desavantatges". Per descomptat, els científics també estan esbrinant com triar el mètode adequat per a un projecte en particular. "En el context de la bioimatge, els factors clau a tenir en compte inclouen: resolució espacial i temporal, sensibilitat al fotodany, capacitat d'etiquetatge, gruix de la mostra i fluorescència de fons o fluorescència autòloga cel·lular". Com funciona Els diversos microscopis de superresolució funcionen de diferents maneres. En el cas de PALM i STORM, només una petita fracció de marcadors fluorescents s'excita o fotoactiva en un moment donat, permetent la seva localització independent amb alta precisió. Passar per aquest procés amb totes les etiquetes fluorescents dóna com a resultat una imatge de superresolució completa. Stefan Hell, un dels guanyadors del Premi Nobel de Química 2014 i director de l'Institut Max Planck de Química Biofísica, va dir: "El sistema PALM/STORM és relativament fàcil d'instal·lar, però és difícil d'aplicar, perquè el fluorescent El grup ha de tenir capacitat de fotoactivació. Limitacions El desavantatge és que necessiten detectar una sola molècula fluorescent en el context d'una cèl·lula, i són menys fiables que STED". STED utilitza un pols làser per excitar el fluoròfor i un làser en forma d'anell per apagar el fluoròfor, deixant només la fluorescència de mida nanomètrica intermèdia per a una superresolució. L'escaneig de tota la mostra produeix una imatge. "L'avantatge de STED és que és una tecnologia de polsador", va explicar Hell. "Funciona com un microscopi de fluorescència confocal estàndard". També pot imatges cèl·lules vives utilitzant fluoròfors com ara proteïnes fluorescents verdes o grogues i colorants derivats de la rodamina. Comparació paramètrica Tot i que totes les tècniques de superresolució superen la microscòpia de llum convencional pel que fa a la resolució, difereixen entre si. SIM duplica aproximadament la resolució a uns 100 nm. PALM i STORM poden resoldre objectius de 15 nm. Segons Hell, STED proporciona una resolució espacial de 30 nm en cèl·lules vives i 15 nm en cèl·lules fixes. Quan es tracta d'aplicacions específiques, també hem de tenir en compte la relació senyal-soroll. En alguns casos, una resolució més baixa però una SNR més alta pot donar lloc a una imatge millor que la contrària (resolució més alta però SNR més baixa). La velocitat d'adquisició d'imatges també és molt important, especialment per a les cèl·lules vives. "Totes les tècniques de super-resolució són més lentes que les tècniques d'imatge de fluorescència convencionals", va dir Stracy. "PALM/STORM és el més lent, necessita desenes de milers de fotogrames per obtenir una sola imatge, SIM necessita desenes de fotogrames i STED és una tecnologia d'escaneig, de manera que la velocitat d'adquisició depèn de la mida del camp de visió". A més de les cèl·lules vives o les cèl·lules fixes d'imatge, alguns científics també volen entendre com es mouen els objectes. A Stracy li interessa entendre la dinàmica dels sistemes biològics a les cèl·lules vives, no només imatges estàtiques. Combina PALM amb el seguiment de partícules individuals per analitzar la dinàmica de les cèl·lules vives. D'aquesta manera, pot seguir directament les molècules marcadores mentre fan les seves funcions. Tanmateix, creu que SIM no és adequat per estudiar aquests processos dinàmics a nivell molecular, però a causa de la seva ràpida velocitat d'adquisició, és especialment adequat per observar la dinàmica d'estructures més grans, com ara cromosomes sencers. Els últims resultats El 2017, l'equip d'Hell va informar del microscopi de superresolució MINFLUX a Science. Segons Hell, aquest mètode de superresolució aconsegueix una resolució espacial d'1 nm per primera vegada. A més, pot fer un seguiment de molècules individuals en cèl·lules vives almenys 100 vegades més ràpid que altres mètodes. Altres científics també van parlar molt bé del microscopi MINFLUX. "S'estan desenvolupant noves aplicacions i enfocaments constantment, però em destaquen dos avenços", va dir Shechtman. Un és MINFLUX. "Utilitza un mètode enginyós per obtenir un posicionament molecular molt precís". Pel que fa al segon desenvolupament emocionant, Shechtman va esmentar WE Moerner i els seus col·legues de la Universitat de Stanford. Moerner també va rebre el Premi Nobel de Química 2014. Un dels guanyadors. Per abordar la limitació de la resolució d'imatge causada per la dispersió anisòtropa de molècules úniques fluorescents, els científics van utilitzar diferents polaritzacions d'excitació per determinar l'orientació i la posició de les molècules. A més, han desenvolupat superfícies pupil·lars delicades. Aquestes tècniques milloren la capacitat de localitzar estructures. Sobre les etiquetes fluorescents En moltes aplicacions de superresolució, les etiquetes realment importen. També hi ha algunes empreses que ofereixen productes relacionats. Per exemple, l'alemanya Miltenyi s'ha associat amb Abberior, una empresa fundada per Stefan Hell, per oferir serveis de conjugació d'anticossos personalitzats per a colorants de microscòpia de superresolució. Altres empreses també ofereixen marcadors coincidents. "Els nostres Nano-Boosters són molt petits, només 1,5 kDa i molt específics", diu Christoph Eckert, responsable de màrqueting de ChromoTek. Aquestes proteïnes s'uneixen a proteïnes fluorescents verdes i vermelles (GFP i RFP). Es deriven de fragments d'anticossos d'alpaca, coneguts com a VHH o nanobodies, amb excel·lents propietats d'unió i qualitat estable sense variació de lot a lot. Aquests marcadors són adequats per a diverses tècniques de superresolució, com ara SIM, PALM, STORM i STED. Ai-Hui Tang, professor assistent a la Facultat de Medicina de la Universitat de Maryland, i els seus col·legues van utilitzar GFP-Booster i STORM de ChromoTek per explorar la propagació de la informació al sistema nerviós. Van trobar nanocúmuls moleculars, anomenats nanocolumnes, a les neurones presinàptiques i postsinàptiques. Els científics creuen que aquesta estructura demostra que el sistema nerviós central utilitza principis senzills per mantenir i regular l'eficiència sinàptica. Diverses versions d'imatges de super-resolució i un nombre creixent de mètodes estan portant els científics encara més a fons en els misteris biològics. En trencar el límit de difracció de la llum visible, els biòlegs poden fins i tot "vigilar de prop" les accions de les cèl·lules.
